Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Mampiasa kinova mpitety tranonkala manana fanohanana CSS voafetra ianao.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Ho fanampin'izany, mba hiantohana ny fanohanana mitohy, dia asehoy ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript.
Sliders mampiseho lahatsoratra telo isaky ny slide.Ampiasao ny bokotra aoriana sy manaraka mba hivezivezena amin'ny slides, na ny bokotra mpanara-maso ny slides amin'ny farany mba hivezivezena amin'ny slide tsirairay.

317 Stainless vy coil fantsona mpamatsy

Tabilao firafitry ny simika amin'ny akora vy tsy misy pentina

SPACA6 dia proteinina ambonin'ny tsirinaina izay tena ilaina amin'ny fifangaroan'ny gamete mandritra ny fananahana ara-pananahana.Na dia eo aza io andraikitra fototra io, ny asa manokana an'ny SPACA6 dia tsy takatry ny saina.Manazava ny firafitry ny krystaly amin'ny sehatra extracellular an'ny SPACA6 izahay amin'ny famahana ny 2.2 Å, izay mampiseho proteinina roa-domaine misy fehezam-boninkazo efatra sy Ig-like β-sandwich miaraka amin'ny mpampitohy quasi-flexible.Ity rafitra ity dia mitovy amin'ny IZUMO1, proteinina hafa mifandray amin'ny gamete fusion, izay mahatonga ny SPACA6 sy IZUMO1 mpikambana mpanorina ny superfamily proteinina mifandraika amin'ny fampiraisana antsoina eto amin'ny hoe superfamily IST.Ny superfamily IST dia voafaritra ara-drafitra amin'ny fehezam-boninkazo efatra helix miolikolika sy motif CXXC mifamatotra disulfide.Ny fikarohana AlphaFold mifototra amin'ny rafitra momba ny proteome olombelona dia nahitana mpikambana proteinina fanampiny amin'ity fianakaviana super ity;indrindra fa maro amin'ireo proteinina ireo no tafiditra amin'ny fifangaroan'ny gamete.Ny firafitry ny SPACA6 sy ny fifandraisany amin'ireo mpikambana hafa ao amin'ny superfamily IST dia manome ny rohy tsy hita ao amin'ny fahalalantsika momba ny fusionan'ny gamete mammalian.
Ny fiainan'ny olombelona tsirairay dia manomboka amin'ny gametes haploid roa misaraka: ny tsirinain'ny rainy sy ny atodin-dreniny.Ity tsirinaina ity no mpandresy amin'ny dingana fifantenana mahery vaika izay ahafahan'ny selan'ny tsirinaina an-tapitrisany mandalo ao amin'ny trakta tao amin'ny taovam-pananahana vehivavy, mandresy ireo sakana isan-karazany1 ary mandalo capacitation, izay manatsara ny fihetsehan'izy ireo sy ny fizotry ny singa ambonin'ny tany2,3,4.Na dia mifankahita aza ny tsirinaina sy ny oocyte dia tsy mbola vita ny dingana.Ny oocyte dia voahodidin'ny sela cumulus sy sakana glycoprotein antsoina hoe zona pellucida, izay tsy maintsy mandalo ny tsirinaina mba hiditra ao amin'ny oocyte.Ny spermatozoa dia mampiasa fitambarana molekiola miraikitra amin'ny ety ambonin'ny tany sy anzima mifandray amin'ny membrane ary miafina mba handresena ireo sakana farany ireo5.Ireo molekiola sy anzima ireo dia voatahiry indrindra ao amin'ny membrane anatiny sy matrix acrosomal ary hita rehefa lysed ny membrane ivelany amin'ny tsirinaina mandritra ny fanehoan-kevitra acrosomal6.Ny dingana farany amin'ity dia mafy ity dia ny hetsika fampivondronana tsirinaina-atody, izay mampifamatotra ny sela roa ho lasa zavamananaina diploid tokana7.Na dia eo amin'ny sehatry ny famokarana olombelona aza io dingana io, dia tsy takatry ny saina ny fifandraisan'ny molekiola ilaina.
Ho fanampin'ny fampiraisana ny gametes, ny simia amin'ny fifangaroan'ny lipida roa dia nodinihina lalina.Amin'ny ankapobeny, ny fusion membrane dia dingana iray tsy dia tsara loatra izay mitaky proteinina catalista mba handalo fiovana ara-drafitra izay mampifanakaiky kokoa ny membranes roa, manapaka ny fitohizan'izy ireo ary miteraka fusion8,9.Ireo catalysts proteinina ireo dia fantatra amin'ny anarana hoe fusogens ary hita ao amin'ny rafitra fusion tsy tambo isaina.Izy ireo dia takiana amin'ny fidiran'ny viriosy ao amin'ny sela mpampiantrano (ohatra, gp160 ao amin'ny VIH-1, spike amin'ny coronaviruses, hemagglutinin amin'ny viriosy gripa)10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 ary fifangaroan'ny gamete amin'ny eukaryotes ambany ( HAP2/GCS1 amin'ny zavamaniry, protista ary arthropods) 16,17,18,19.Fusogens ho an'ny gametes olombelona dia mbola tsy hita, na dia misy proteinina maromaro aza no hita fa manakiana ny fametahana gamete sy ny fusion.Ny CD9 misy oocyte, proteinina transmembrane ilaina amin'ny fampifangaroana ny totozy sy ny gametes olombelona, ​​no voalohany hita 21,22,23.Na dia mbola tsy mazava tsara aza ny asany, dia misy anjara asa amin'ny adhesion, ny firafitry ny adhesion foci amin'ny microvilli atody, ary / na ny toerana mety amin'ny proteinina ambonin'ny oocyte dia toa 24,25,26.Ny proteinina roa mahazatra indrindra izay manakiana ny fusionan'ny gamete dia ny proteinina sperm IZUMO127 sy ny proteinina oocyte JUNO28, ary ny fikambanan'izy ireo dia dingana manan-danja amin'ny fanekena ny gamete sy ny adhesion alohan'ny fusion.Ny totozy knockout Izumo1 lahy sy ny totozy Juno knockout vavy dia sterile tanteraka, amin'ireo modely ireo ny tsirinaina dia miditra amin'ny habaka perivitelline fa ny gametes dia tsy mitambatra.Toy izany koa, nihena ny fifandonana rehefa notsaboina tamin'ny anti-IZUMO1 na JUNO27,29 antibody ny gametes amin'ny andrana fampiraisana amin'ny olombelona.
Vao haingana, nisy vondrona proteinina mitovitovy amin'ny IZUMO1 sy JUNO20,30,31,32,33,34,35 vao hita vao haingana.Ny sperm acrosomal membrane-associated protein 6 (SPACA6) dia fantatra fa tena ilaina amin'ny fampiraisana amin'ny fandalinana mutagenesis murine lehibe.Ny fampidirana ny transgène ao amin'ny fototarazo Spaca6 dia mamokatra spermatozoa tsy azo ampiasaina, na dia miditra ao amin'ny habaka perivitelline aza ireo spermatozoa ireo.Ny fandalinana knockout manaraka tamin'ny totozy dia nanamafy fa ny Spaca6 dia ilaina amin'ny gamete fusion 30,32.Ny SPACA6 dia aseho saika ao amin'ny testes ary manana lamina localization mitovy amin'ny an'ny IZUMO1, izany hoe ao anatin'ny intima amin'ny spermatozoa alohan'ny fanehoan-kevitra acrosomal, ary avy eo dia mifindra any amin'ny faritra ekoatorialy aorian'ny fanehoan-kevitra acrosomal 30,32.Ny homologues Spaca6 dia misy amin'ny karazana biby mampinono sy eukaryotes hafa 30 ary ny maha-zava-dehibe azy amin'ny fifangaroan'ny gamete olombelona dia naseho tamin'ny alàlan'ny fanakanana ny fampiraisana olombelona in vitro amin'ny fanoherana ny SPACA6 30.Tsy toy ny IZUMO1 sy JUNO, ny antsipirian'ny rafitra, ny fifandraisana ary ny fiasan'ny SPACA6 dia mbola tsy mazava.
Mba hahatakarana bebe kokoa ny dingana fototra fototry ny fifangaroan'ny tsirinaina sy ny atody, izay ahafahantsika mampahafantatra ny fivoarana ho avy amin'ny fandrindrana ny fianakaviana sy ny fitsaboana ny fahavokarana, dia nanao fandalinana ara-drafitra sy biochemical SPACA6 izahay.Ny firafitry ny kristaly amin'ny sehatra extracellular an'ny SPACA6 dia mampiseho fehezam-boninkazo efatra helika (4HB) sy sehatra immunoglobulin-toy ny (Ig-like) mifandray amin'ny faritra mora azo.Araka ny efa nambara mialoha tamin'ny fanadihadiana teo aloha, 7,32,37 ny firafitry ny sehatra SPACA6 dia mitovy amin'ny an'ny IZUMO1 olombelona, ​​​​ary ny proteinina roa dia mizara motif tsy mahazatra: 4HB miaraka amin'ny sehatra helika telozoro sy ny motif CXXC mifandray amin'ny disulfide.Manoro hevitra izahay fa ny IZUMO1 sy SPACA6 izao dia mamaritra ny proteinina lehibe kokoa sy mifandraika amin'ny rafitra mifandraika amin'ny fusion gamete.Amin'ny fampiasana endri-javatra tokana ho an'ny superfamily, dia nanao fikarohana feno momba ny proteome olombelona ara-drafitra AlphaFold izahay, hamantatra ireo mpikambana fanampiny amin'ity superfamily ity, anisan'izany ny mpikambana maromaro tafiditra amin'ny fusion gamete sy/na fampiraisana.Hita ankehitriny fa misy vala ara-drafitra mahazatra sy superfamily proteinina mifandray amin'ny fusion gamete, ary ny rafitra misy antsika dia manome sarintany molekiola amin'ity lafiny manan-danja amin'ny mekanika fusion gamete olombelona ity.
SPACA6 dia proteinina transmembrane tokana mandeha amin'ny glycan iray mifandray amin'ny N sy fatorana disulfide enina (sary S1a sy S2).Naneho ny sehatra extracellular an'ny SPACA6 olombelona (sisa 27-246) ao amin'ny sela Drosophila S2 izahay ary nanadio ny proteinina tamin'ny fampiasana ny nickel affinity, ny fifanakalozana cation, ary ny chromatography fanilikilihana ny habeny (sary S1b).Ny ectodomain SPACA6 voadio dia tena marin-toerana sy homogeneous.Ny famakafakana amin'ny fampiasana krômatôgrafia fanilikilihana habe miaraka amin'ny fanaparitahana hazavana polygonal (SEC-MALS) dia nahitana tampon'isa iray miaraka amin'ny lanjan'ny molekiola kajy 26.2 ± 0.5 kDa (sary S1c).Izany dia mifanaraka amin'ny haben'ny ectodomain monomeric SPACA6, izay manondro fa tsy nisy ny oligomerization nandritra ny fanadiovana.Ankoatra izany, ny spectroscopy circular dichroism (CD) dia nanambara rafitra α / β mifangaro miaraka amin'ny teboka 51.3 ° C (sary S1d, e).Ny deconvolution amin'ny spectra CD dia nanambara ny singa 38.6% α-helical sy 15.8% β-stranded (sary S1d).
Ny ectodomain SPACA6 dia natao kristaly tamin'ny fampiasana famafazana matrix random38 ka nahatonga ny angon-drakitra misy famahana ny 2.2 Å (Table 1 sy sary S3).Amin'ny fampiasana fampifangaroana ny fanoloana molekiola mifototra amin'ny sombin-javatra sy ny angon-drakitra fizotry ny SAD miaraka amin'ny fiparitahan'ny bromide ho an'ny famaritana ny rafitra (Table 1 sy Sary S4), ny modely voadio farany dia misy sisa 27-246.Tamin'ny fotoana namaritana ny rafitra dia tsy nisy rafitra fanandramana na AlphaFold azo.Ny ectodomain SPACA6 dia mirefy 20 Å × 20 Å × 85 Å, misy helika fito sy β-tady sivy, ary manana vala tertiary elongated miorina amin'ny fatorana disulfide enina (sary 1a, b).Ny hakitroky ny elektronika malemy amin'ny faran'ny rojo Asn243 dia manondro fa ity ambiny ity dia glycosylation mifandray amin'ny N.Ny rafitra dia misy sehatra roa: ny N-terminal four-helix bundle (4HB) ary ny C-terminal Ig-like domain izay misy faritra midadasika eo anelanelan'izy ireo (sary 1c).
Ny rafitry ny sehatra extracellular an'ny SPACA6.Esory ny sarin'ny sehatra extracellular an'ny SPACA6, ny lokon'ny rojo manomboka amin'ny N mankany C-terminus manomboka amin'ny manga maizina mankany amin'ny mena maizina.Ny cysteinees tafiditra amin'ny fatorana disulfide dia asongadina amin'ny magenta.b Topology amin'ny sehatra extracellular an'ny SPACA6.Ampiasao ny loko mitovy amin'ny sary 1a.c SPACA6 extracellular domain.Ny sari-tanin'ny sehatra 4HB, hinge, ary Ig dia miloko volomboasary, maitso ary manga.Ny sosona dia tsy voasintona araka ny habeny.
Ny sehatra 4HB an'ny SPACA6 dia ahitana helika efatra lehibe (helices 1-4), izay nalamina amin'ny endrika helika helika (sary 2a), mifandimby eo amin'ny fifandraisana antiparallel sy parallel (sary 2b).Misy helix kely mihodikodina kely fanampiny (helix 1′) apetraka mifanandrify amin'ilay amboara, ka mamorona telozoro misy helika 1 sy 2. Ity telozoro ity dia simba kely ao amin'ny fonon'ny helika miolikolika amin'ny fonon'ny helika 3 sy 4 ( sary 2a).
4HB N-terminal strip tabilao.b Ny fijery ambony amin'ny amboara misy helika efatra, ny helix tsirairay dia asongadina amin'ny manga maizina eo amin'ny N-terminus ary mena maizina amin'ny C-terminus.c Sarin-kodiarana miolikolika ambony midina ho an'ny 4HB, miaraka amin'ny ambiny tsirairay aseho amin'ny endrika boribory misy marika amino asidra misy litera tokana;ny asidra amino efatra eo an-tampon'ny kodia ihany no isaina.Ny sisa tsy polar dia miloko mavo, ny sisa tavela tsy misy polar dia miloko maitso, miloko manga ny ambiny miendrika tsara, ary miloko mena ny ambiny miiba.d Endriky telozoro amin'ny sehatra 4HB, misy 4HB amin'ny volomboasary ary maitso maitso.Ny sisiny roa dia mampiseho fatorana disulfide miendrika tsorakazo.
Ny 4HB dia mifantoka amin'ny atiny hydrophobic anatiny izay ahitana ny sisa tavela alifatika sy aromatika (sary 2c).Ny fotony dia misy fifamatorana disulfide eo amin'ny Cys41 sy Cys55 izay mampifandray ny helika 1 sy 2 miaraka amin'ny telozoro ambony ambony (sary 2d).Fatorana disulfide roa fanampiny no niforona teo anelanelan'ny motif CXXC tao amin'ny Helix 1 ′ sy ny motif CXXC hafa hita teo amin'ny tendron'ny β-hairpin ao amin'ny faritra hinge (sary 2d).Ny sisa tavela amin'ny arginine mpandala ny nentin-drazana miaraka amin'ny fiasa tsy fantatra (Arg37) dia hita ao anatin'ny telozoro poakaty noforonin'ny helices 1′, 1, ary 2. Ny atôma karbônina alifatika Cβ, Cγ, ary Cδ Arg37 dia mifandray amin'ny fototry ny hydrophobic, ary ny vondrona guanidineny dia mihetsika tsikelikely. eo anelanelan'ny helices 1′ sy 1 amin'ny alàlan'ny fifandraisana misy eo amin'ny taolam-paty Thr32 sy ny rojo sisiny (sary S5a, b).Tyr34 dia miitatra ao anaty lavaka ka mamela lavaka kely roa ahafahan'ny Arg37 mifandray amin'ny solvent.
Ig-like β-sandwich domains dia superfamily lehibe amin'ny proteinina izay mizara ny endri-javatra iraisan'ny roa na maromaro amphipathic β-sheet mifanerasera amin'ny alalan'ny hydrophobic core 39. Ny C-terminal Ig-tahaka domain ny SPACA6 dia mitovy lamina ary misy sosona roa (sary S6a).Ny takelaka 1 dia β-sheet misy kofehy efatra (tady D, F, H, ary I) izay misy kofehy F, H, ary I mandrafitra firindrana tsy mifanipaka, ary ny tadiny I sy D dia mifandray mifanila.Ny tabilao 2 dia takelaka beta kely misy tady roa mifanandrify (tady E sy G).Nisy fifamatorana disulfide anatiny hita teo anelanelan'ny C-terminus amin'ny rojo E sy ny afovoan'ny rojo H (Cys170-Cys226) (sary S6b).Ity fifamatorana disulfide ity dia mitovy amin'ny fifamatorana disulfide ao amin'ny sehatra β-sandwich an'ny immunoglobulin40,41.
Ny β-sheet misy tady efatra dia mihodina amin'ny halavany manontolo, mamorona sisiny asymmetrika izay tsy mitovy amin'ny endriny sy ny electrostatika.Ny sisiny manify dia ny tontolo iainana hydrophobic fisaka izay misongadina raha oharina amin'ny sisa tavela uneven sy electrostatically surfaces isan-karazany ao amin'ny SPACA6 (sary S6b, c).Ny halo amin'ny vondrona karbônina/amino ao amin'ny hazondamosina mibaribary sy rojo vy amin'ny lafiny polar dia manodidina ny tampon'ny hydrophobic (sary S6c).Ny sisiny midadasika kokoa dia rakotry ny ampahany helika voasarona izay manakana ny ampahany N-terminal amin'ny fototry ny hydrophobic ary mamorona fatorana hidrozenina telo miaraka amin'ny vondrona polar misokatra amin'ny backbone F rojo (sary S6d).Ny ampahany C-terminal amin'ity sisiny ity dia mamorona paosy lehibe misy fotony hydrophobic ampahany.Ny paosy dia voahodidin'ny fiampangana tsara noho ny andiany telo amin'ny sisa tavela arginine (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ary Arg212-Arg214) ary histidine afovoany (His220) (sary S6e).
Ny faritra hinge dia ampahany fohy eo amin'ny sehatra helika sy ny sehatra mitovy amin'ny Ig, izay misy β-layer antiparallel telo mipetaka (tady A, B ary C), helix kely 310, ary fizarana helika lava maromaro.(sary S7).Ny tambajotran'ny fifandraisana covalent sy electrostatique ao amin'ny faritra hinge dia toa mampitombina ny orientation eo anelanelan'ny 4HB sy ny sehatra Ig.Azo zaraina telo ny tambajotra.Ny tapany voalohany dia misy motif CXXC roa (27CXXC30 sy 139CXXC142) izay mamorona fatorana disulfide roa eo anelanelan'ny β-hairpin ao amin'ny hinge sy ny helix 1' amin'ny 4HB.Ny ampahany faharoa dia ahitana fifandraisana electrostatic eo amin'ny sehatra Ig-tahaka sy ny hinge.Ny Glu132 ao amin'ny hinge dia mamorona tetezana sira miaraka amin'i Arg233 ao amin'ny sehatra Ig ary Arg135 ao amin'ny hinge.Ny ampahany fahatelo dia misy fifamatorana covalent eo amin'ny sehatra Ig-like sy ny faritra hinge.Ny fatorana disulfide roa (Cys124-Cys147 sy Cys128-Cys153) dia mampifandray ny tadivavarana amin'ny rohy iray izay miorina amin'ny fifandraisana elektrostatika eo amin'ny Gln131 sy ny vondrona miasa ao an-damosina, mamela ny fidirana amin'ny sehatra Ig voalohany.rojo.
Ny firafitry ny ectodomain SPACA6 sy ny firafitry ny tsirairay amin'ny sehatra 4HB sy Ig dia nampiasaina mba hikaroka firaketana mitovy amin'ny rafitra ao amin'ny tahiry proteinina 42.Nofantarinay ny lalao misy naoty Dali Z avo, fivilian-dàlana kely, ary naoty LALI lehibe (ity farany dia ny isan'ny sisa tavela amin'ny rafitra).Raha ny 10 hitsimoka voalohany avy amin'ny fikarohana ectodomain feno (Table S1) dia nanana Z-score azo ekena amin'ny>842, ny fikarohana momba ny sehatra 4HB na Ig irery dia nampiseho fa ny ankamaroan'ireo hitsoka ireo dia nifanaraka tamin'ny β-sandwich ihany.vala hita eny rehetra eny amin'ny proteinina maro.Ny fikarohana telo tao Dali dia tsy nitondra afa-tsy valiny iray: IZUMO1.
Efa ela no nanoro hevitra fa ny SPACA6 sy IZUMO1 dia mizara fitoviana ara-drafitra7,32,37.Na dia ny ectodomains amin'ireo proteinina roa mifandray amin'ny gamete fusion aza dia tsy mizara afa-tsy 21% ny maha-izy azy (sary S8a), porofo sarotra, anisan'izany ny lamina fifamatorana disulfide voatahiry ary ny sehatra C-terminal Ig-like ao amin'ny SPACA6, dia namela ny fanandramana voalohany hananganana modely homolojia an'ny totozy A sy SPACA6 mampiasa IZUMO1 ho template37.Ny rafitray dia manamafy ireo faminaniana ireo ary mampiseho ny tena haavon'ny fitoviana.Raha ny marina, ny rafitra SPACA6 sy IZUMO137,43,44 dia mizara rafitra roa mitovy (sary S8b) miaraka amin'ny sehatra 4HB sy Ig mitovy amin'ny β-sandwich mifandray amin'ny faritra hinge (sary S8c).
Ny IZUMO1 sy SPACA6 4HB dia manana fahasamihafana mahazatra amin'ny amboara miolikolika mahazatra.Ny 4HBs mahazatra, toy ireo hita ao amin'ny komples proteinina SNARE tafiditra ao amin'ny fusion endosomal 45,46, dia manana helika mitovitovy amin'ny fihazonana curvature tsy tapaka manodidina ny axis afovoany 47. Mifanohitra amin'izany kosa, ny sehatra helika ao amin'ny IZUMO1 sy SPACA6 dia nivadika, miaraka amin'ny curvature miovaova ary fonosana tsy mitovy (sary S8d).Ny fihodinana, angamba vokatry ny telozoro noforonin'ny helices 1′, 1 ary 2, dia tazonina ao amin'ny IZUMO1 sy SPACA6 ary miorina amin'ny motif CXXC mitovy amin'ny helix 1′.Na izany aza, ny fatorana disulfide fanampiny hita ao amin'ny SPACA6 (Cys41 sy Cys55 mifamatotra amin'ny helices 1 sy 2 etsy ambony) dia mamorona tendrony maranitra kokoa amin'ny tendrony telozoro, ka mahatonga ny SPACA6 mihodinkodina kokoa noho ny IZUMO1, miaraka amin'ny telozoro lava lava kokoa.Ankoatr'izay, ny IZUMO1 dia tsy manana Arg37 hita ao afovoan'ity lavaka ity ao amin'ny SPACA6.Mifanohitra amin'izany kosa, ny IZUMO1 dia manana fototra hydrophobic mahazatra kokoa amin'ny sisa tavela alifatika sy aromatika.
Ny IZUMO1 dia manana sehatra mitovy amin'ny Ig izay misy β-sheet43 misy tady roa sy dimy.Ny kofehy fanampiny ao amin'ny IZUMO1 dia manolo ny coil ao amin'ny SPACA6, izay mifandray amin'ny kofehy F mba hamerana ny fatorana hidrozenina ao amin'ny tady.Ny teboka iray mahaliana fampitahana dia ny fiampangana ety ambonin'ny vinavina amin'ny sehatra mitovy amin'ny Ig amin'ireo proteinina roa.Ny surface IZUMO1 dia misy fiampangana ratsy kokoa noho ny surface SPACA6.Misy fiampangana fanampiny hita eo akaikin'ny C-terminus manoloana ny membrane sperm.Ao amin'ny SPACA6, ireo faritra ireo ihany no tsy miandany na voampanga tsara (sary S8e).Ohatra, ny hydrophobic surface (tsisin'ny manify) sy ny lavaka misy fiampangana tsara (sisiny midadasika kokoa) ao amin'ny SPACA6 dia voampanga ratsy ao amin'ny IZUMO1.
Na dia voatahiry tsara aza ny fifandraisana sy ny singa ara-drafitra faharoa eo amin'ny IZUMO1 sy SPACA6, ny fampifanarahana ara-drafitra amin'ny sehatra Ig dia mampiseho fa ny sehatra roa dia tsy mitovy amin'ny orientation ankapobeny mifandraika amin'ny tsirairay (sary S9).Ny amboara spiral an'ny IZUMO1 dia miolakolaka manodidina ny β-sandwich, mamorona ny endrika "boomerang" voalaza teo aloha eo amin'ny 50 ° avy amin'ny axe afovoany.Mifanohitra amin'izany kosa, ny taratra helika ao amin'ny SPACA6 dia mitongilana eo amin'ny 10 ° amin'ny lalana mifanohitra.Ny fahasamihafan'ireo orientation ireo dia azo inoana fa noho ny fahasamihafana eo amin'ny faritra hinge.Ao amin'ny ambaratonga voalohany, ny IZUMO1 sy SPACA6 dia mizara fitoviana kely amin'ny filaharana, afa-tsy ny cystine, glycine, ary ny sisa tavela amin'ny asidra aspartika.Vokatr'izany, ny fatorana hidrozenina sy ny tambajotra elektrostatika dia samy hafa tanteraka.Ny β-sheet second structure element dia zarain'ny IZUMO1 sy SPACA6, na dia lava kokoa aza ny rojo ao amin'ny IZUMO1 ary ny 310 helix (helix 5) dia miavaka amin'ny SPACA6.Ireo fahasamihafana ireo dia miteraka orientation sehatra samihafa ho an'ny proteinina roa mitovy.
Ny fikarohana mpizara Dali anay dia nanambara fa ny SPACA6 sy IZUMO1 ihany no rafitra roa voafaritry ny andrana voatahiry ao amin'ny tahiry proteinina izay manana an'io fold 4HB manokana io (Table S1).Vao haingana, DeepMind (Alphabet/Google) dia namolavola AlphaFold, rafitra mifototra amin'ny tambajotra neural izay afaka maminavina tsara ny firafitry ny proteinina 3D avy amin'ny sequences voalohany48.Fotoana fohy taorian'ny namaha ny rafitra SPACA6, dia navoaka ny angon-drakitra AlphaFold, manome modely firafitra vinavina mandrakotra ny 98.5% amin'ny proteinina rehetra ao amin'ny proteome48,49.Amin'ny fampiasana ny rafitra SPACA6 voavaha ho modely fikarohana, fikarohana homolojia ara-drafitra ho an'ny modely ao amin'ny proteome olombelona AlphaFold dia nanondro ireo kandidà manana fitoviana ara-drafitra amin'ny SPACA6 sy IZUMO1.Raha jerena ny fahamarinan'ny AlphaFold amin'ny faminaniany ny SPACA6 (sary S10a) - indrindra ny ectodomain 1.1 Å rms raha oharina amin'ny rafitra voavahantsika (sary S10b) - dia afaka matoky isika fa mety ho marina ireo lalao SPACA6 fantatra.
Teo aloha, ny PSI-BLAST dia nitady ny cluster IZUMO1 miaraka amin'ny proteinina telo hafa mifandraika amin'ny tsirinaina: IZUMO2, IZUMO3, ary IZUMO450.AlphaFold dia naminavina fa ireo proteinina fianakaviana IZUMO ireo dia miforitra ao amin'ny sehatra 4HB miaraka amin'ny lamina fatorana disulfide mitovy amin'ny IZUMO1 (sary 3a sy S11), na dia tsy manana sehatra Ig aza izy ireo.Heverina fa ny IZUMO2 sy IZUMO3 dia proteinina membrane iray mitovy amin'ny IZUMO1, raha toa kosa ny IZUMO4 dia miafina.Ny asan'ny proteinina IZUMO 2, 3, ary 4 amin'ny fusion gamete dia tsy voafaritra.IZUMO3 dia fantatra fa mandray anjara amin'ny biogenesis acrosome mandritra ny fivoaran'ny spermatozoa51, ary ny proteinina IZUMO dia mamorona complex50.Ny fiarovana ny proteinina IZUMO amin'ny biby mampinono, ny biby mandady ary ny amphibians dia manondro fa ny mety ho fiasan'izy ireo dia mifanaraka amin'ny proteinina hafa fantatra amin'ny gamete-fusion, toy ny DCST1 / 2, SOF1, ary FIMP.
Diagram amin'ny maritrano sahan'ny IST superfamily, miaraka amin'ny sehatra 4HB, hinge, ary Ig mitovitovy amin'ny loko voasary, maitso ary manga.IZUMO4 dia manana faritra C-terminal tokana izay toa mainty.Ny fatorana disulfide voamarina sy azo antoka dia aseho amin'ny tsipika mivaingana sy misy teboka.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-FEM9), (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-FEM9) DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) dia aseho amin'ny loko mitovy amin'ny tontonana A. Ny fatorana disulfide dia aseho amin'ny magenta.TMEM95, IZUMO2 ary IZUMO3 transmembrane helices dia tsy aseho.
Tsy toy ny proteinina IZUMO, ny proteinina SPACA hafa (izany hoe, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, ary SPACA9) dia heverina ho tsy mitovy amin'ny SPACA6 (sary S12).Ny SPACA9 ihany no manana 4HB, saingy tsy antenaina ny hanana orientation parallel-anti-parallel mitovy amin'ny fatorana disulfide mitovy amin'ny SPACA6.SPACA1 ihany no manana sehatra mitovy amin'ny Ig.AlphaFold dia maminavina fa ny SPACA3, SPACA4 ary SPACA5 dia manana rafitra hafa tanteraka noho ny SPACA6.Mahaliana fa ny SPACA4 dia fantatra ihany koa fa mandray anjara amin'ny fampiraisana, fa amin'ny ankapobeny kokoa noho ny SPACA6, fa manamora ny fifandraisana misy eo amin'ny tsirinaina sy ny oocyte zona pellucida52.
Ny fikarohanay AlphaFold dia nahita lalao hafa ho an'ny IZUMO1 sy SPACA6 4HB, TMEM95.Ny TMEM95, proteinina transmembrane tokana miavaka amin'ny tsirinaina, dia mahatonga ny totozy lahy tsy miteraka rehefa abla 32,33.Ny spermatozoa tsy misy TMEM95 dia nanana morphologie ara-dalàna, fihetsehana, ary fahafahana miditra ao amin'ny zona pellucida ary mifatotra amin'ny fonon'ny atody, saingy tsy afaka mitambatra amin'ny membrane oocyte.Ny fanadihadiana teo aloha dia naneho fa ny TMEM95 dia mizara fitoviana ara-drafitra amin'ny IZUMO133.Raha ny marina, ny modely AlphaFold dia nanamafy fa ny TMEM95 dia 4HB miaraka amin'ny motif CXXC mitovy amin'ny IZUMO1 sy SPACA6 ary ny fifamatorana disulfide fanampiny eo amin'ny helices 1 sy 2 hita ao amin'ny SPACA6 (sary 3a sy S11).Na dia tsy manana sehatra mitovy amin'ny Ig aza ny TMEM95, dia manana faritra misy lamina fatorana disulfide mitovy amin'ny faritra hinge SPACA6 sy IZUMO1 (sary 3b).Tamin'ny fotoana namoahana an'ity sora-tanana ity, ny mpizara preprint dia nitatitra ny firafitry ny TMEM95, nanamafy ny valiny AlphaFold53.TMEM95 dia mitovy amin'ny SPACA6 sy IZUMO1 ary voatahiry amin'ny evolisiona efa ao amin'ny amphibians (sary 4 sy S13).
Ny fikarohana PSI-BLAST dia nampiasa ny angona NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, ary SOF1 mba hamaritana ny toerana misy ireo filaharana ireo ao amin'ny hazon'aina.Ny elanelana misy eo amin'ny teboka sampana dia tsy aseho amin'ny ambaratonga.
Ny fitoviana ara-drafitra amin'ny ankapobeny eo amin'ny SPACA6 sy IZUMO1 dia manondro fa izy ireo dia mpanorina mpikambana ao amin'ny superfamily structural voatahiry izay ahitana ny proteinina TMEM95 sy IZUMO 2, 3, ary 4.mpikambana fantatra: IZUMO1, SPACA6 ary TMEM95.Satria mpikambana vitsivitsy ihany no manana sehatra mitovy amin'ny Ig, ny mari-pamantarana amin'ny fianakaviana super IST dia ny sehatra 4HB, izay manana endri-javatra miavaka mahazatra amin'ireo proteinina rehetra ireo: 1) Mihodinkodina 4HB miaraka amin'ny helika voalamina amin'ny fifandimbiasana anti-parallel / parallel (sary). . 5a), 2) ny fehezam-boninkazo dia manana endrika telozoro misy helika roa ao anatin'ilay amboara ary helix mitsangana fahatelo (sary faritra manan-danja (sary 5c). ho sensor redox 54,55,56, raha ny motif ao amin'ny fianakaviana IST dia azo ampifandraisina amin'ny isomerase proteinina disulfide toy ny ERp57 amin'ny fusion gamete.
Ny mpikambana ao amin'ny superfamily IST dia faritana amin'ny endri-javatra telo mampiavaka ny sehatra 4HB: helika efatra mifandimby eo anelanelan'ny orientation parallèle sy antiparallel, tarehin-tarehimarika ba-triangular helical, ary motif roa ca CXXC miforona eo anelanelan'ny molekiola kely.) Helixes N-terminal (voasary) sy faritra hinge β-hairpin (maitso).
Raha jerena ny fitoviana misy eo amin'ny SPACA6 sy IZUMO1, dia nosedraina ny fahafahan'ny teo aloha mifatotra amin'ny IZUMO1 na JUNO.Ny biolayer interferometry (BLI) dia fomba fiasa mifototra amin'ny kinetika izay efa nampiasaina taloha mba hamaritana ny fifandraisana misy eo amin'ny IZUMO1 sy JUNO.Taorian'ny fampidirana ny sensor biotin-labeled miaraka amin'ny IZUMO1 ho toy ny baomba miaraka amin'ny analyte JUNO avo lenta, dia nisy famantarana mahery vaika hita (sary S14a), izay manondro ny fiovan'ny fatorana amin'ny hatevin'ny biomaterial mipetaka amin'ny tendron'ny sensor.Famantarana mitovitovy (izany hoe, JUNO mitambatra amin'ny sensor ho toy ny baomba amin'ny analyte IZUMO1) (sary S14b).Tsy nisy famantarana hita rehefa nampiasa SPACA6 ho toy ny analyte amin'ny IZUMO1 na sensor-bound JUNO (sary S14a, b).Ny tsy fisian'io famantarana io dia manondro fa ny sehatra extracellular an'ny SPACA6 dia tsy mifandray amin'ny sehatra extracellular an'ny IZUMO1 na JUNO.
Satria ny BLI assay dia mifototra amin'ny biotinylation ny sisa tavela amin'ny lysine maimaim-poana amin'ny proteinina bait, ity fanovana ity dia afaka manakana ny fatorana raha toa ka tafiditra ao anatin'ny fifandraisana ny sisa tavela amin'ny lysine.Ankoatr'izay, ny fiorenan'ny fatorana mifandraika amin'ny sensor dia mety miteraka sakana, noho izany dia natao ihany koa ny fitsirihana mahazatra amin'ny ectodomains SPACA6, IZUMO1 ary JUNO.Na dia teo aza izany, ny SPACA6 dia tsy nipoitra tamin'ny IZUMO1 na ny JUNO (sary S14c, d), izay tsy misy fifandraisana mifanaraka amin'ny fanandramana BLI.Amin'ny maha-fifehezana tsara azy, dia nanamafy ny fifandraisan'ny JUNO izahay miaraka amin'ny anarana hoe IZUMO1 (sary S14e sy S15).
Na dia eo aza ny fitoviana ara-drafitra eo amin'ny SPACA6 sy IZUMO1, ny tsy fahafahan'ny SPACA6 mamatotra an'i JUNO dia tsy mahagaga.Ny velaran'ny IZUMO1 olombelona dia manana sisa tavela mihoatra ny 20 izay mifandray amin'ny JUNO, anisan'izany ny sisa tavela avy amin'ny faritra telo (na dia ao amin'ny faritry ny hinge aza ny ankamaroany) (sary S14f).Amin'ireo sisa tavela ireo dia iray ihany no voatahiry ao amin'ny SPACA6 (Glu70).Raha maro ny fanoloana sisa tavela no nitazona ny fananany biochemika tany am-boalohany, ny sisa Arg160 tena ilaina ao amin'ny IZUMO1 dia nosoloina ny Asp148 tsy misy fiampangana ao amin'ny SPACA6;Ny fikarohana teo aloha dia naneho fa ny fiovan'ny Arg160Glu ao amin'ny IZUMO1 dia saika manafoana tanteraka ny fatorana amin'ny JUNO43.Ankoatr'izay, ny fahasamihafana eo amin'ny orientation domaine eo amin'ny IZUMO1 sy SPACA6 dia nampitombo be ny velaran'ny tranokala JUNO-mamatotra ny faritra mitovy amin'ny SPACA6 (sary S14g).
Na dia eo aza ny filàna SPACA6 ho an'ny fusion gamete sy ny fitoviana amin'ny IZUMO1, ny SPACA6 dia toa tsy manana fiasa mitovy amin'ny JUNO mifamatotra.Noho izany, nikatsaka ny hanambatra ny angon-drakitra ara-drafitra miaraka amin'ny porofon'ny maha zava-dehibe omen'ny biolojia evolisiona izahay.Ny filaharan'ireo homologues SPACA6 dia mampiseho ny fiarovana ny rafitra iraisana ankoatra ny biby mampinono.Ohatra, misy ny sisa tavela amin'ny cystine na dia amin'ny amphibians mifandray lavitra aza (sary 6a).Amin'ny fampiasana ny mpizara ConSurf, ny angon-drakitra fitehirizana ny filaharana maromaro amin'ny filaharana 66 dia nalaina an-tsarintany teo amin'ny sehatra SPACA6.Ity karazana famakafakana ity dia afaka mampiseho hoe iza no sisa tavela nandritra ny fivoaran'ny proteinina ary afaka manondro hoe iza amin'ireo faritra ambonin'ny tany no mandray anjara amin'ny asany.
fampifanarahana ny ectodomains SPACA6 avy amin'ny karazana 12 samihafa nomanina tamin'ny fampiasana CLUSTAL OMEGA.Araka ny fanadihadiana nataon'ny ConSurf, ny toerana tena mpandala ny nentin-drazana dia voamarika amin'ny manga.Ny sisa tavela amin'ny cysteine ​​​​dia nasongadina mena.Ny sisin-tany sy ny singa rafitra faharoa dia aseho eo an-tampon'ny fampifanarahana, izay misy zana-tsipìka manondro ny β-strands ary ny onja dia manondro helices.Ny NCBI Access Identifiers misy ny filaharana dia: olombelona (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), rajako capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), soavaly (Equus caballus, XP_02_02rca3, XP_01821277) 3 XP_032_034) .), ondry (Ovis aries, XP_014955560), elefanta (Loxodonta africana, XP_010585293), alika (Canis lupus familyis, XP_025277208), totozy (Mus musculus, NP_001156381) ypus, 8) , 61_89 ary Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Ny fanisana dia mifototra amin'ny filaharan'olombelona.b Sarin'ny endrik'ilay rafitra SPACA6 miaraka amin'ny 4HB eo an-tampony ary sehatra mitovy amin'ny Ig eo amin'ny farany ambany, loko mifototra amin'ny tombantomban'ny fiarovana avy amin'ny mpizara ConSurf.Ny ampahany tsara indrindra voatahiry dia manga, ny ampahany antonony voatahiry dia fotsy, ary ny kely indrindra voatahiry dia mavo.cystine volomparasy.Ny paty telo amin'ny ety ivelany mampiseho fiarovana avo dia aseho ao amin'ny takelaka misy marika 1, 2 ary 3. Misy sariitatra 4HB aseho eo amin'ny sisiny ambony havanana (mitovitovy loko).
Ny rafitra SPACA6 dia manana faritra telo tena voaaro (sary 6b).Ny Patch 1 dia mamakivaky ny 4HB sy ny faritra hinge ary misy tetezana disulfide CXXC roa voatahiry, tamba-jotra Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (sary S7), ary telo sisa tavela aromatika ivelany (Phe31, Tyr73, Phe137)).sisiny midadasika kokoa amin'ny sehatra sahala amin'ny Ig (sary S6e), izay maneho ireo sisa tavela misy fiampangana tsara eo amin'ny tampon'ny tsirinaina.Mahaliana fa ity patch ity dia misy epitope antibody izay efa naseho teo aloha fa manelingelina ny fiasan'ny SPACA6 30.Ny faritra 3 dia mamakivaky ny elatra sy ny ilany iray amin'ny sehatra mitovy amin'ny Ig;Ity faritra ity dia misy proline voatahiry (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ary ny sisa tavela amin'ny polar/charged ivelany.Mahagaga fa ny ankamaroan'ny sisa tavela eo ambonin'ny 4HB dia miovaova be (sary 6b), na dia voatahiry manerana ny homologue SPACA6 aza ny vala (araka ny asehon'ny conservatism ny fototry ny bozaka hydrophobic) ary mihoatra ny superfamily IST.
Na dia io aza no faritra kely indrindra ao amin'ny SPACA6 miaraka amin'ireo singa ara-drafitra faharoa faran'izay kely indrindra, maro ny sisa tavela amin'ny faritra hinge (anisan'izany ny faritra 3) no tena voatahiry ao anatin'ireo homologues SPACA6, izay mety manondro fa ny orientation ny bundle helical sy ny β-sandwich dia mitana anjara toerana.toy ny mpandala ny nentin-drazana.Na izany aza, na dia eo aza ny fatorana hydrogène sy tambajotra elektrônika ao amin'ny faritra hinge amin'ny SPACA6 sy IZUMO1, ny porofon'ny fahaleovan-tena ao anatiny dia azo jerena amin'ny fampifanarahana ireo rafitra navela IZUMO137,43,44.Nifanindry tsara ny fampifanarahana ny sehatra tsirairay, fa ny fiorenan'ny sehatra mifandraika amin'ny tsirairay dia miovaova amin'ny 50 ° ka hatramin'ny 70 ° avy amin'ny axis afovoany (sary S16).Mba hahatakarana ny dinamika conformational an'ny SPACA6 amin'ny vahaolana, dia natao ny fanandramana SAXS (sary S17a, b).Ab initio fanavaozana ny SPACA6 ectodomain nifanaraka tamin'ny rafitra kristaly tsorakazo (sary S18), na dia ny Kratky plot dia nampiseho ambaratongam-flexibility (sary S17b).Ity fampifanarahana ity dia mifanohitra amin'ny IZUMO1, izay ahitana ny proteinina tsy voafatotra dia manana endrika boomerang na ao amin'ny lattice na amin'ny vahaolana43.
Mba hamantarana manokana ny faritra malefaka, dia natao tamin'ny SPACA6 ny hydrogène-deuterium exchange mass spectroscopy (H-DXMS) ary nampitahaina tamin'ny angona azo tamin'ny IZUMO143 (sary 7a, b).Ny SPACA6 dia miharihary kokoa noho ny IZUMO1, araka ny asehon'ny fifanakalozana deuterium avo kokoa manerana ny rafitra aorian'ny fifanakalozana 100,000.Ao amin'ireo rafitra roa ireo, ny ampahany C-terminal amin'ny faritra hinge dia mampiseho fifanakalozam-bola avo lenta, izay mety mamela ny fihodinana voafetra amin'ny sehatra 4HB sy Ig mifandraika amin'ny tsirairay.Mahaliana fa ny ampahany C-terminal amin'ny entona SPACA6, izay misy ny sisa tavela amin'ny 147CDLPLDCP154, dia faritra voaaro be 3 (sary 6b), izay mety manondro fa ny fahafahan'ny interdomain dia singa iray voatahiry amin'ny evolisiona SPACA6.Araka ny fanadihadiana momba ny flexibilité, ny angon-drakitra mafana CD dia nampiseho fa ny SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) dia tsy miorina tsara noho ny IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (sary S1e sy S19).
sary H-DXMS an'ny SPACA6 sy b IZUMO1.Ny tahan'ny fifanakalozana deuterium dia nofaritana tamin'ny fotoana voatondro.Ny haavon'ny fifanakalozana hidrôzenina-deuterium dia aseho amin'ny loko amin'ny maridrefy mitongilana manomboka amin'ny manga (10%) ka hatramin'ny mena (90%).Ny boaty mainty dia maneho ny faritra misy fifanakalozana avo lenta.Ny sisin-tanin'ny 4HB, hinge ary Ig-tahaka ny sehatra hita ao amin'ny rafitra kristaly dia aseho eo ambonin'ny filaharana voalohany.Ny haavon'ny fifanakalozana Deuterium amin'ny 10 s, 1000 s, ary 100,000 s dia nopetahana teo amin'ny tabilao mipetaka eo amin'ny molekiola mangarahara amin'ny SPACA6 sy IZUMO1.Ny ampahany amin'ny rafitra misy haavon'ny fifanakalozana deuterium eo ambanin'ny 50% dia miloko fotsy.Ny faritra mihoatra ny 50% ny fifanakalozana H-DXMS dia miloko amin'ny ambaratonga miandalana.
Ny fampiasana ny CRISPR/Cas9 sy ny tetik'ady fototarazo famonoan'ny totozy dia nitarika ny famantarana ireo lafin-javatra maro manan-danja ho an'ny tsirilahy sy ny atody mifamatotra sy ny fusion.Ankoatra ny fifandraisana tsara amin'ny IZUMO1-JUNO sy ny rafitra CD9, ny ankamaroan'ny proteinina mifandray amin'ny fusion gamete dia mijanona ho enigmatic ara-drafitra sy miasa.Ny mari-pamantarana biophysika sy ara-drafitra amin'ny SPACA6 dia ampahany iray amin'ny piozila molekiola adhesion / fusion mandritra ny fampiraisana.
Ny SPACA6 sy ny mpikambana hafa ao amin'ny fianakaviana super IST dia toa voatahiry be amin'ny biby mampinono ary koa ny vorona tsirairay, ny biby mandady ary ny amphibiana;raha ny marina, heverina fa ny SPACA6 aza dia ilaina amin'ny fampiraisana amin'ny zebrafish 59. Ity fizarana ity dia mitovy amin'ny proteinina hafa mifandraika amin'ny gamete fusion toy ny DCST134, DCST234, FIMP31, ary SOF132, izay milaza fa ireo singa ireo dia tsy ampy HAP2 (koa. fantatra amin'ny anarana hoe GCS1) proteinina izay tompon'andraikitra amin'ny hetsika catalytic ataon'ny protista maro., zavamaniry ary arthropoda.Ny proteinina fusion fertilized 60, 61. Na dia eo aza ny fitoviana ara-drafitra matanjaka eo amin'ny SPACA6 sy IZUMO1, ny fandosiran'ny fototarazo mandika ny iray amin'ireo proteinina ireo dia nahatonga ny tsy fahampian-tsakafo amin'ny totozy lahy, izay manondro fa ny asany amin'ny fusion gamete dia tsy duplicated..Amin'ny ankapobeny, tsy misy na dia iray aza amin'ireo proteinina tsirinaina fantatra ilaina amin'ny dingana adhesion amin'ny fusion.
Mijanona ho fanontaniana misokatra raha toa ka mandray anjara amin'ny junction intergametic ny SPACA6 (sy ireo mpikambana hafa ao amin'ny superfamily IST), mamorona tambajotra intragametic mba haka proteinina manan-danja amin'ny teboka fusion, na mety ho toy ny fusogens sarotra.Ny fandalinana miaraka amin'ny immunoprecipitation ao amin'ny sela HEK293T dia nanambara fifandraisana misy eo amin'ny IZUMO1 sy SPACA632 feno.Na izany aza, ny recombinant ectodomains dia tsy nifanerasera tamin'ny vitro, izay nanoro hevitra fa ny fifandraisana hita ao amin'ny Noda et al.dia samy voafafa tamin'ny fananganana (mariho ny rambony cytoplasmic an'ny IZUMO1, izay hita fa tsy ilaina amin'ny fertilization62).Raha tsy izany, ny IZUMO1 sy/na ny SPACA6 dia mety mitaky tontolo mifamatotra manokana izay tsy avoakantsika in vitro, toy ny conformations manokana ara-batana na complexes molecular misy proteinina hafa (fantatra na mbola tsy hita).Na dia inoana aza fa ny ectodomain IZUMO1 dia manelanelana ny fampifandraisana ny spermatozoa amin'ny atody ao amin'ny habaka perivitelline, ny tanjon'ny ectodomain SPACA6 dia tsy mazava.
Ny firafitry ny SPACA6 dia manambara sehatra maro voatahiry izay mety ho tafiditra amin'ny fifandraisana proteinina-proteinina.Ny ampahany voatahiry ao amin'ny faritra hinge mifanakaiky avy hatrany amin'ny motif CXXC (voatondro Patch 1 etsy ambony) dia misy sisa tavela ety ivelany izay matetika mifandray amin'ny fifandraisana hydrophobic sy π-stacking eo amin'ny biomolekul.Ny sisiny midadasika amin'ny sehatra Ig-tahaka (faritra 2) dia mamorona gorodona misy fiampangana tsara miaraka amin'ny Arg voatahiry be sy ny sisa tavela aminy, ary ny antibiôsy manohitra an'io faritra io dia efa nampiasaina taloha mba hanakanana ny gamete fusion 30 .Ny antibody dia manaiky ny epitope linear 212RIRPAQLTHRGTFS225, izay misy telo amin'ireo sisa tavela amin'ny arginine enina ary tena voatahiry ny His220.Tsy fantatra mazava na noho ny fanakanana ireo sisa tavela manokana ireo na ny faritra iray manontolo no nahatonga ny dysfunction.Ny toerana misy an'io hantsana io eo akaikin'ny C-terminus an'ny β-sandwich dia manondro ny fifandraisana cis amin'ny proteinina tsirinaina mifanakaiky, fa tsy amin'ny proteinina oocyte.Fanampin'izany, ny fihazonana ny tebiteby manankarena amin'ny proline (site 3) ao anatin'ny hinge dia mety ho toerana misy fifandraisana proteinina-proteinina na, azo inoana kokoa, manondro ny fihazonana ny flexibilité eo amin'ireo sehatra roa.Zava-dehibe ny maha-lahy na maha-vavy amin'ny anjara asan'ny SPACA6 tsy fantatra.fifangaroan'ny gametes.
SPACA6 dia manana fananana proteinina adhesion intercellular, anisan'izany ny β-sandwich Ig.Proteinina adhesive maro (ohatra, cadherins, integrins, adhesins, ary IZUMO1) dia manana sehatra β-sandwich iray na maromaro izay manitatra proteinina avy amin'ny membrane sela mankany amin'ny tanjona ara-tontolo iainana63,64,65.Ny sehatra mitovy amin'ny Ig an'ny SPACA6 dia misy motif hita matetika ao amin'ny β-sandwich misy adhesion sy cohesion: roa sosona amin'ny tady mifanitsy amin'ny faran'ny β-sandwich, fantatra amin'ny anarana hoe clamps mekanika66.Inoana fa io motif io dia mampitombo ny fanoherana ny herim-pandrefesana, izay sarobidy ho an'ny proteinina tafiditra amin'ny fifandraisana intercellular.Na izany aza, na dia eo aza izany fitoviana amin'ny adhesins, dia tsy misy porofo amin'izao fotoana izao fa ny SPACA6 dia mifandray amin'ny fotsy atody.Ny ectodomain SPACA6 dia tsy afaka mifatotra amin'ny JUNO, ary ny sela HEK293T izay maneho ny SPACA6, araka ny aseho eto, dia zara raha mifandray amin'ny oocytes tsy misy zona 32.Raha toa ny SPACA6 dia mametraka fifamatorana intergametic, ireo fifandraisana ireo dia mety mitaky fanovana aorian'ny fandikana na fanamafisana amin'ny proteinina sperm hafa.Ho fanohanana ny petra-kevitra farany, ny spermatozoa tsy ampy IZUMO1 dia mifatotra amin'ny oocytes, izay mampiseho fa ny molekiola ankoatra ny IZUMO1 dia tafiditra ao amin'ny dingana 27 adhesion gamete.
Maro ny proteinina fusion virtoaly, cellules ary developmental no manana toetra izay maminavina ny asany ho fusogens.Ohatra, ny glycoproteins fusion viriosy (kilasy I, II ary III) dia manana peptide fusion hydrophobic na tadivavarana amin'ny faran'ny proteinina izay ampidirina ao amin'ny membrane mpampiantrano.Ny sarintanin'ny hydrophilicity an'ny IZUMO143 sy ny firafitry ny IST superfamily dia tsy nahitana peptide fusion hydrophobic hita.Noho izany, raha misy proteinina ao amin'ny superfamily IST miasa ho fusogens, dia manao izany amin'ny fomba tsy mitovy amin'ny ohatra hafa fantatra.
Ho fehin-kevitra, ny asan'ny mpikambana ao amin'ny IST superfamily proteinina mifandray amin'ny gamete fusion dia mijanona ho mistery mampihomehy.Ny molekiolan'ny recombinant SPACA6 miavaka sy ny rafitra voavaha dia hanome fanazavana momba ny fifandraisana misy eo amin'ireo rafitra ifampizarana ireo sy ny anjara asany amin'ny fametahana gamete sy ny fusion.
Ny filaharan'ny ADN mifandraika amin'ny ectodomain SPACA6 efa voalaza mialoha (NCBI laharan'ny fidirana NP_001303901.1; residues 27-246) dia codon-optimized ho an'ny fitenenana ao amin'ny sela Drosophila melanogaster S2 ary novolavolaina ho ampahany amin'ny fototarazo miaraka amin'ny filaharan'ny Kozak (Eurofins Genomics)., ny famantarana sekretera BiP ary ny 5′ sy 3′ mifanaraka amin'izany dia mifarana amin'ny cloning tsy miankina amin'ny ligation an'io fototarazo io ho vector expression pMT mifototra amin'ny mpanentana metallothionein novaina ho an'ny fifantenana amin'ny puromycin (pMT-puro).Ny véctor pMT-puro dia manodinkodina ny tranokalan'ny thrombin ary arahin'ny marika 10x-His C-terminal (sary S2).
Ny fifindrana tsy miovaova amin'ny vector SPACA6 pMT-puro ao amin'ny sela D. melanogaster S2 (Gibco) dia natao mitovy amin'ny protocola ampiasaina amin'ny IZUMO1 sy JUNO43.Ny sela S2 dia nalevina ary nitombo tao amin'ny medium Schneider's (Gibco) nampian'ny fifantohana farany tamin'ny 10% (v / v) serum zanak'omby foetus (Gibco) tsy misy hafanana ary 1X antibiotika antimycotic (Gibco).Ny selan'ny andalana voalohany (3.0 x 106 sela) dia nopetahana tao anaty lavadrano tsirairay misy takelaka 6 (Corning).Taorian'ny 24 ora incubation amin'ny 27 ° C, ny sela dia nafindra tamin'ny fifangaroan'ny 2 mg ny SPACA6 pMT-puro vector sy ny Effectene transfection reagent (Qiagen) araka ny protocole mpanamboatra.Ny sela nafindra dia natsipy nandritra ny 72 ora ary avy eo nojinjaina tamin'ny puromycin 6 mg / ml.Avy eo dia natokana ny sela avy amin'ny fitaovana Schneider feno ary napetraka ao amin'ny medium Insect-XPRESS (Lonza) tsy misy serum ho an'ny famokarana proteinina lehibe.Ny ampahany 1 L ny kolontsaina sela S2 dia nitombo ho 8-10 × 106 ml-1 sela ao amin'ny 2 L ventilated flat-bottomed polypropylene Erlenmeyer tavoara ary avy eo sterilized amin'ny fifantohana farany ny 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) sy sterile voasivana.induced.Ny kolontsaina induced dia natsofoka tamin'ny 27 ° C. tamin'ny 120 rpm nandritra ny efatra andro.
Ny medium conditioned misy SPACA6 dia natokana tamin'ny centrifugation tamin'ny 5660 × g amin'ny 4 ° C arahin'ny rafitra filtration mikoriana Centramate tangential (Pall Corp) miaraka amin'ny membrane 10 kDa MWCO.Ampiharo amin'ny tsanganana 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen) ny medium concentrate misy SPACA6.Ny resin'ny Ni-NTA dia nosasana tamin'ny tsanganana 10 volume (CV) an'ny buffer A ary avy eo dia nampiana 1 CV an'ny buffer A mba hanomezana ny imidazole farany amin'ny 50 mM.SPACA6 dia nesorina tamin'ny 10 ml buffer A nampian'ny imidazole hatramin'ny fifantohana farany amin'ny 500 mM.Ny thrombin kilasy famerana (Millipore Sigma) dia nampidirina mivantana tao amin'ny fantsona dialyse (MWCO 12-14 kDa) amin'ny 1 unit isaky ny mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ary 150 mM NaCl (buffer B) ho an'ny dialyse.) amin’ny 4°C mandritra ny 48 ora.Ny SPACA6 nopotehina thrombin dia nopotehina in-telo mba hampihenana ny fifantohana sira ary napetaka tamin'ny tsanganana 1 ml MonoS 5/50 GL cation exchange (Cytiva / GE) nampitoviana tamin'ny 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Ny mpanakalo cation dia nosasana tamin'ny 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, avy eo ny SPACA6 dia nopotehina tamin'ny gradient linear avy amin'ny 0 ka hatramin'ny 500 mm NaCl amin'ny 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 ho an'ny 25 OK.Taorian'ny chromatography fifanakalozana ion, SPACA6 dia nifantoka tamin'ny 1 ml ary eluted isocratically avy amin'ny ENrich SEC650 10 x 300 tsanganana (BioRad) equilibrated amin'ny buffer B. Araka ny chromatogram, dobo sy concentrate fractions misy SPACA6.Ny fahadiovana dia nofehezin'ny electrophoresis voapoizina Coomassie amin'ny gel 16% SDS-polyacrylamide.Ny fifantohan'ny proteinina dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny absorbance amin'ny 280 nm amin'ny fampiasana ny lalàna Beer-Lambert sy ny coefficient famongorana molara teorika.
Ny SPACA6 voadio dia nodiovina nandritra ny alina tamin'ny phosphate sodium 10 mM, pH 7.4 ary 150 mM NaF ary natsofoka tamin'ny 0.16 mg / mL alohan'ny fanadihadiana amin'ny spectroscopy CD.Ny scanning spectral CDs amin'ny onjam-peo 185 ka hatramin'ny 260 nm dia nangonina tamin'ny spectropolarimeter Jasco J-1500 mampiasa cuvettes quartz miaraka amin'ny halavan'ny lalana optika 1 mm (Helma) amin'ny 25 ° C amin'ny tahan'ny 50 nm / min.Ny CD spectra dia voahitsy baseline, salan'isa mihoatra ny 10 acquisitions, ary niova ho mean residual ellipticity (θMRE) amin'ny degre cm2/dmol:
izay MW dia ny lanjan'ny molekiola isaky ny santionany ao Da;N ny isan'ny asidra amino;θ dia ny ellipticity amin'ny milidegree;d mifanitsy amin'ny halavan'ny lalana optique amin'ny cm;proteinina fifantohana amin'ny vondrona.