ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube ho an'ny singa simika indostrian'ny simika, Ny tsy fahampian'ny SPECC1L dia mitarika amin'ny fitomboan'ny tonon-taolana mifamatotra sy ny fihenan'ny sela crest neural cranial.

Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Mampiasa kinova mpitety tranonkala manana fanohanana CSS voafetra ianao.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Ho fanampin'izany, mba hiantohana ny fanohanana mitohy, dia asehoy ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube ho an'ny indostrian'ny simika

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.dia mpanamboatra malaza izay manam-pahaizana manokana amin'ny fantsona tsy misy vy tsy misy vy, fantsona annealed mamiratra, fantsona mihodinkodina tsy misy dikany sns.Mba hanamora ny mpanjifa dia manana fantsona sy fantsona ihany koa izahay.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.manana fitaovana famokarana sy fitiliana mandroso indrindra.Afaka manome fahafaham-po tanteraka ny zavatra takinao izahay.Araka ny fenitra tena hentitra, ny fantsona izay novokarinay dia manana fandeferana OD sy WT marina foana.Ny fanaraha-maso ny fandeferana dia mifanaraka tanteraka amin'ny famokarana fenitra.Ny vokatray dia afa-po amin'ny mpanjifa hatrany.Nividy ny vokatray ny mpanjifa dia nahazo tombony bebe kokoa.
a) OD (Savaivony ivelany): 3.18mm hatramin'ny 101.6mm
b) WT (Hatevin'ny rindrina): 0.5mm hatramin'ny 20mm
c) Length: Araka ny takian'ny mpanjifa
d) Fenitra : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 sy
e) Fomba fiasa: ERW, EFW sns

Sliders mampiseho lahatsoratra telo isaky ny slide.Ampiasao ny bokotra aoriana sy manaraka mba hivezivezena amin'ny slides, na ny bokotra mpanara-maso ny slides amin'ny farany mba hivezivezena amin'ny slide tsirairay.
Ny cellules crest neural cranial (CNCC) dia manala ny vala neural embryonic ary mifindra any amin'ny andohalambo pharyngeal, izay mamorona ny ankamaroan'ny rafitra afovoany.Ny dysfunction CNCC dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny etiology of cleft orofacial, malformation congenital mahazatra.Ny fiovan'ny SPECC1L heterozygous dia hita amin'ny marary manana cleft atypical sy syndromic.Eto izahay dia mitatitra ny fanamafisana ny singa canonical adhesive junction (AJ), β-catenin sy E-cadherin ao amin'ny cellule knockdown SPECC1L kolontsaina, ary ny mikrografy elektronika dia mampiseho ny fiparitahan'ny apical-basal an'ny AJ.Mba hahatakarana ny anjara asan'ny SPECC1L amin'ny morphogenesis craniofacial dia namorona modely totozy tsy ampy Specc1l izahay.Ny mutants homozygous dia mahafaty embryonika ary mampiseho ny fanakatonana fantsona neural sy ny lamination CNCC.Ny fandokoana proteinina AJ dia mitombo ao amin'ny vala neural mutant.Ity kilema AJ ity dia mifanaraka amin'ny lesoka amin'ny delamination CNCC, mitaky ny famongorana ny AJ.Ankoatr'izay, ny mutants Specc11 dia nampihena ny famantarana PI3K-AKT ary nitombo ny apoptose.In vitro, ny fanakanana malefaka amin'ny famantarana PI3K-AKT ao amin'ny sela bibidia dia ampy hanentanana ny fiovan'ny AJ.Ny tena zava-dehibe dia ny fiovan'ny AJ ateraky ny fandondonana SPECC1L dia azo averina amin'ny alàlan'ny fampahavitrihana ny lalana PI3K-AKT.Raha atambatra, ireo angon-drakitra ireo dia manoro hevitra fa ny SPECC1L, amin'ny maha-mpandrindra vaovao momba ny famantarana PI3K-AKT sy ny biolojia AJ, dia takiana amin'ny fanakatonana fantsona neural sy ny stratification CNCC.
Ny cellules neural crest cranial (CNCCs) dia mipetraka amin'ny neuroectoderm dorsal ary miala amin'ny neuroepithelium amin'ny valan-javaboary mivoatra amin'ny alàlan'ny dingana iray misy ny fifindrana epithelial-mesenchymal (EMT)1,2,3.Ny CNCC epithelial mialohan'ny fifindra-monina dia manakorontana ny fihaonan'ny intercellular ary lasa CNCC mesenchymal mifindra monina izay mameno ny andohalambo pharyngeal voalohany sy faharoa ary mamorona ny ankamaroan'ny cartilage craniofacial.Noho izany, ny fototarazo izay mifehy ny fiasan'ny CNCC dia matetika voakorontana amin'ny etiology ny tsy fahampian-tsakafo craniofacial toy ny clefts orofacial, izay matetika misy fiantraikany amin'ny fahaterahana 1/800 any Etazonia irery.Iray amin'ireo deformation hatrany am-bohoka8.
Ny fanidiana ny CNCC dia mifanandrify amin'ny fanakatonana ny fantsona neural anteriora eo anelanelan'ny 8.5 sy 9.5 andro amin'ny fivoaran'ny embryon amin'ny totozy.Ny mutants amin'ny fototarazo mifandraika amin'ny totozy orofacial cleft dia mampiseho endrika tsy fahampian-tsakafo neural, anisan'izany ny Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, ary Pdgfrα12.Na izany aza, ny fizotry ny fanakatonana fantsona neural sy ny stratification CNCC dia azo heverina ho mahaleo tena, satria ny totozy Splotch mutant (Pax3) dia mampiseho lesoka amin'ny fanakatonana fantsona neural tsy misy fiantraikany amin'ny stratification CNCC na ny fifindra-monina 13,14.Ny maodely totozy fanampiny misy lesoka amin'ny dissection CNCC sy ny fanakatonana fantsona neural dia hanampy amin'ny famaritana ny fototry ny molekiola mahazatra amin'ireo dingana roa ireo.
Ny fitokana-monina ny CNCC avy amin'ny sela neuroepithelial dia mitaky ny famongorana ny adhesive junctions (AJs), izay ahitana proteinina complexes misy, ankoatra ny hafa, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, ary α-actinin mifandray amin'ny filaments actin 2 . Ny fandinihana tafahoatra ny E-cadherin amin'ny vala neural dia nampiseho fihenana na fahatarana amin'ny delamination CNCC.Mifanohitra amin'izany, ny fanafoanana ny E-cadherin dia miteraka stratification voalohany15,16.Maro amin'ireo lafin-javatra izay manelanelana ny EMT mandritra ny stratification CNCC dia ny transcription factor (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ary extracellular matrix (ECM) remodeling proteinina toy ny matrix metalloproteinases (MMPs), fa ny CNCCs dia cytoskeletal AJ regulator mivantana. tsy mbola fantatra.Ny lalana PI3K-AKT dia fantatra fa manohitra ny haavon'ny E-cadherin, indrindra amin'ny fikarohana momba ny homamiadana17.Ny fanadihadiana vao haingana dia naneho fa ny fahaverezan'ny famantarana PI3K-AKT mifototra amin'ny PDGFα amin'ny totozy dia mitarika amin'ny tsy fetezana craniofacial, anisan'izany ny cleft palate sy ny neural tube defects12.Na izany aza, ny fifandraisana misy eo amin'ny lalana PI3K-AKT sy ny fahamarinan-toerana AJ amin'ny stratification CNCC dia tsy mazava.
Efa fantatray teo aloha ny SPECC1L ho fototarazo mutant voalohany amin'ny olona roa manana tselatra mafy izay manomboka amin'ny vava mankany amin'ny maso, fantatra amin'ny anarana hoe oblique cleft (ObFC) na Tessier IV18 cleft.Ny fiovan'ny SPECC1L dia hita ao amin'ny fianakaviana roa multigenerational miaraka amin'ny autosomal dominant Opitz G / BBB syndrome (OMIM #145410), izay nahitana olona voan'ny hyperdistance sy cleft lip / palate19, ary ao amin'ny fianakaviana iray miaraka amin'ny Syndrome overdistance Tibi (OMIM #145420)20 .mihoatra ny antsasaky ny trangan'ny aretin'i Opitz G/BBB dia mifandray X (OMIM #300000) ary vokatry ny fiovan'ny fototarazo MID1, izay mamadika ny proteinina 22 amin'ny taolam-paty mifandray amin'ny microtubule.Mihevitra izahay fa ny SPECC1L, proteinina mifandray amin'ny microtubules sy ny cytoskeleton actin, dia mety hanelanelana famantarana ilaina amin'ny fanavaozana ny cytoskeleton actin mandritra ny fifindran'ny sela sy ny fifindra-monina 18.Amin'ny alàlan'ny fandalinana in vitro sy in vivo dia mamaritra ny SPECC1L ho toy ny mpandrindra vaovao momba ny fahamarinan'ny AJ amin'ny alàlan'ny famantarana PI3K-AKT izahay.Ao amin'ny ambaratonga sela, ny tsy fahampian'ny SPECC1L dia nahatonga ny fihenan'ny haavon'ny proteinina pan-AKT ary ny fitomboan'ny fiparitahan'ny apical-basal an'ny AJ, izay nesorina tamin'ny fampahavitrihana simika ny lalan'ny AKT.Ao amin'ny vivo, ny embryon tsy ampy Specc11 dia mampiseho ny fanakatonana fantsona neural sy ny fihenan'ny CNCC.Noho izany, ny SPECC1L dia miasa amin'ny famandrihana mifototra amin'ny sela voafehy tena ilaina amin'ny fiasan'ny CNCC mahazatra mandritra ny morphogenesis amin'ny tarehy.
Mba hamaritana ny anjara asan'ny SPECC1L amin'ny ambaratonga sela, dia nampiasa ny tsy fahampian'ny cellule osteosarcoma efa voalaza teo aloha izahay amin'ny SPECC1L18.Ireo sela U2OS stable miaraka amin'ny SPECC1L (kd) nandondona dia nihena antonony (60-70%) ny haavon'ny transcripts sy proteinina SPECC1L, miaraka amin'ny lesoka amin'ny fifindra-monina sy ny fanavaozana ny cytoskeleton actin 18. Ny SPECC1L dia hita fa mitarika ho amin'ny tsy fahampiana mitotic 23 .Rehefa avy nanamarika bebe kokoa dia hitanay fa ny sela SPECC1L-kd stable dia nanova ny morphologie tamin'ny ambaratonga avo lenta (sary 1).Ny sela fanaraha-maso tsirairay sy ny sela kd amin'ny fifandonana ambany dia nitovy (sary 1A,D).24 ora taorian'ny fusion, ny sela fanaraha-maso dia nitazona ny bikany cuboidal (sary 1B, E), raha ny sela SPECC1L-kd kosa dia nitazona (sary 1C, F).Ny halehiben'io fiovan'ny endrik'ny sela io dia nalaina tamin'ny sary mivantana amin'ny sela fanaraha-maso sy sela kd (sarimihetsika 1).Mba hamaritana ny anjara asan'ny SPECC1L amin'ny sela mifamatotra, dia nandinika ny fiteniny aloha izahay.Hitanay fa nitombo ny haavon'ny proteinina SPECC1L tamin'ny fusion (sary 1G), fa tsy nitombo ny haavon'ny transcript SPECC1L (sary 1H).Ankoatra izany, rehefa nitombo ny haavon'ny sela, ny proteinina SPECC1L dia niangona teo amin'ny sisin'ny intercellular (sary 2A-E), miaraka amin'ny lamina mifanindry amin'ny β-catenin mifandray amin'ny membrane (sary 2A'-E').Raha jerena ny fikambanan'ny SPECC1L amin'ny cytoskeleton actin 18,23 dia nihevitra izahay fa ny SPECC1L dia mifandray amin'ny junctions adhesive (AJ) mifototra amin'ny actin.
(AF) SPECC1L knockdown (DF) cellules elongate amin'ny confluence avo (F) raha ampitahaina amin'ny fanaraha-maso ny cellules U2OS (AC).Aseho eto ny telo amin'ireo teboka enina (T1, T3, T6) izay nofantenantsika ho an'ny hamafin'ny sela samihafa.(G) Famakafakana blot tandrefana mampiseho fa ny proteinina SPECC1L dia miorina amin'ny ambaratonga avo lenta raha ampitahaina amin'ny ambaratonga ambany ao amin'ny sela mifehy.Ny blot tandrefana amin'ny SPECC1L dia mampiseho ny tarika 120 kDa andrasana sy ny bandy lanja molekiola ambony kokoa, mety ho novaina taorian'ny fandikana (*).Ny famakafakana blot tandrefana dia natao tao anatin'ny fepetra mitovy amin'ny fifamatorana ambany sy avo.Sary mampiseho SPECC1L amin'ny fifandonana ambany sy avo dia nalaina tamin'ny blot iray ihany.Nesorina io blot io ary nojerena indray tamin'ny antibody β-actin.(H) Ny fanadihadiana RT-PCR quantitative dia tsy nahitana fiovana lehibe teo amin'ny haavon'ny transcript SPECC1L.Ny bara diso dia maneho SEM avy amin'ny fanandramana tsy miankina efatra.
(AE) Nisafidy teboka enina izahay (T1-T6) misolo tena ny haben'ny sela mba hanamafisana ny famakafakana ny endriky ny sela sy ny fiovan'ny AJ ao amin'ny sela U2OS miaraka amin'ny SPECC1L knockdown (kd).Ny dimy voalohany amin'ireo teboka ireo dia nahitana sela tokana (T1), 50-70% fusion ny clusters sela kely (T2), fusion tsy misy fanavaozana ny sela kd (T3), ny fanavaozana ny sela kd (T4), ary ny fiovan'ny ora 24.amin'ny endriky ny sela kd (T5).Ny proteinina SPECC1L dia niparitaka be indrindra tao amin'ny cytoplasm ao amin'ny T1 (A), fa ny fanangonana azy dia hita teo amin'ny sisin'ny intercellular amin'ny fotoana manaraka (B-E, zana-tsipìka).(FJ) β-catenin dia mampiseho fivondronana mitovy amin'ny sisintany intercellular mifandray amin'ny complex AJ.(A'-E') SPECC1L sy β-catenin dia mampiseho fandotoana mifanindry eo amin'ny sisintanin'ny sela amin'ny hakitroky ny sela (zana-tsipìka).(F'-J') Ao amin'ny sela SPECC1L-kd, ny lokon'ny β-catenin dia miseho ara-dalàna amin'ny hakitroky ny sela ambany (F'-H'), saingy mivelatra rehefa miova ny endriky ny sela (I', J'; zana-tsipìka), izay manondro fa AJ niova.Bara = 10 µm.
Avy eo dia niezaka ny hamantatra ny fiantraikan'ny tsy fahampian'ny SPECC1L amin'ny AJ izahay.Nampiasa marika maromaro mifandraika amin'ny AJ izahay, anisan'izany ny singa kanônika F-actin, myosin IIb, β-catenin, ary E-cadherin24,25,26,27.Nitombo ny fibra adin'ny aktin ao amin'ny sela SPECC1L-kd araka ny voalaza teo aloha (sary 3A,B) 18.Ny Myosin IIb mifandray amin'ny filamenta aktin dia nampiseho fitomboana mitovy amin'ny sela SPECC1L-kd in vitro (sary 3C, D).Ny β-catenin mifandray amin'ny AJ dia mifamatotra amin'ny cadherin ao amin'ny membrane cellule, mampiseho ny fomba fitenenana "tantely" mahazatra amin'ny cubocytes mifehy (sary 3E, G).Mahaliana fa amin'ny sary fisaka mampiasa mikroskopika confocal, ny β-catenin (sary 3E, F) sy ny E-cadherin (sary 3G, H) eo amin'ny fonon'ny selan'ny sela tsy ampy SPECC1L dia nampiseho lamina misongadina amin'ny fandotoana lava.Ity fanitarana ny fandokoana β-catenin mifandraika amin'ny AJ ao amin'ny sela kd ity dia tena nambara tamin'ny fihaonambe, saingy toa nialoha ny fiovan'ny endriky ny sela (sary 2F-J, F'-J').Mba hamaritana ny toetra ara-batana amin'ity fandokoana AJ miitatra ity, dia nandinika ny sisin'ny sela eo amin'ny tampon'ny apical-basal ny sela SPECC1L-kd U2OS amin'ny alàlan'ny microscopy electron transmission (TEM) (sary 3I, J).Mifanohitra amin'ny sela fanaraha-maso (sary 3I), izay manana faritra matevina elektronika misaraka manondro ny AJ (zana-tsipìka), ny sela kd (sary 3J) dia nampiseho faritra lehibe sy mifanakaiky amin'ny hakitroky elektronika avo lenta manondro ny AJ amin'ny fiaramanidina apicobasal..Ankoatra izany, tamin'ny fizarana transverse, dia nahatsikaritra ny fonon'ny sela be dia be ao amin'ny sela kd (sary S1A, B), izay manazava ny lamina miitatra amin'ny β-catenin sy E-cadherin staining bands (sary 3F, H).Ho fanohanana ny andraikitry ny SPECC1L ao amin'ny AJs, ny β-catenin dia niara-niasa tamin'ny SPECC1L tamin'ny lysates ny sela U2OS mitambatra (sary 3K).Miaraka amin'ny immunostaining lava ho an'ny marika AJ, ny fanadihadiana TEM dia nifanaraka tamin'ny fiheveranay fa ny tsy fahampian'ny SPECC1L dia mampitombo ny haavon'ny AJ apical-basal sy ny fahasamihafana.
(AH) Nitombo F-actin staining ao amin'ny kd sela amin'ny 48 ora aorian'ny fusion (T6; A, B).Fandotoana ny myosin IIb mifandray amin'ny F-actin (C, D).Ny lamina malefaka amin'ny β-catenin sy E-cadherin membrane staining ao amin'ny sela fanaraha-maso (E, G) dia nohatsaraina tao amin'ny sela SPECC1L-kd (F, H).Bara = 10 µm.(I-J) Mikrografy elektronika mijery ny fihaonan'ny intercellular apical-basal.Ny selan'ny fanaraha-maso dia mampiseho faritra misy elektrôna miavaka izay manondro fihaonan-doha (I, zana-tsipìka).Mifanohitra amin'izany kosa, ny fihaonan'ny apical-basal manontolo ao amin'ny sela SPECC1L-kd dia niseho elektronika matevina (J, zana-tsipìka), izay manondro ny fitomboan'ny hakitroky sy ny fiparitahan'ny adhesive junctions.(K) β-catenin dia niara-niasa tamin'ny SPECC1L tao amin'ny lysates sela U2OS.Sary nalaina avy amin'ny toerana iray maneho ny iray amin'ireo andrana tsy miankina efatra.
Mba hahatakarana ny anjara asan'ny SPECC1L amin'ny morphogenesis craniofacial, dia namorona modely totozy tsy ampy Specc1l izahay tamin'ny fampiasana andalana roa tsy miankina ES fandrika, DTM096 sy RRH048 (BayGenomics, CA), izay misolo tena ny transcript intron 1 sy Specc1l dia voasambotra tamin'ny 15 (sary 1) .4A, sary S2).Ny toerana misy ny génomika amin'ny fampidirana vector decoy dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny filaharan'ny genome manontolo ary nohamafisin'ny PCR (sary S2).Ny famolavolana fandrika fototarazo roa dia namela ny fampifangaroana an'ireo mpanao gazety Specc11-lacZ rehefa voasambotra.Noho izany, ny fitenenana lacZ voafaritry ny fandokoana X-gal dia nampiasaina ho famantarana ny fanehoana Specc11.Ireo alleles roa ireo dia samy nampiseho endrika mitovy amin'ny lacZ, miaraka amin'ny fandrika fototarazo DTM096 ao amin'ny intron 1 mampiseho fanehoana matanjaka kokoa noho ny RRH048 ao amin'ny intron 15 (tsy aseho).Na izany aza, ny Specc1l dia aseho amin'ny ankapobeny, miaraka amin'ny fanehoana mahery vaika indrindra amin'ny vala neural ao amin'ny E8.5 (sary 4B), ao amin'ny fantsona neural sy ny fizotran'ny tarehy amin'ny E9.5 sy E10.5 (sary 4C, D), ary amin'ny fivoaran'ny rantsambatana. ny e10.5 sy maso (sary 4D).Notaterinay teo aloha fa ny fanehoana SPECC1L ao amin'ny andohalambo pharyngeal voalohany amin'ny E10.5 dia hita ao amin'ny epithelium sy ny mesenchyme18, mifanaraka amin'ny tsipika CNCC.Mba hitsapana ny fitenenana SPECC1L ao amin'ny CNCC, dia nanao fikandrana neural E8.5 izahay (sary 4E-J) sy fizarana karandoha E9.5 (sary 4K-).Ao amin'ny E8.5, ny SPECC1L dia nandrakotra mafy ny vala neural (sary 4E, H), anisan'izany ny sela voaloto amin'ny marika NCC (sary 4G, J).Ao amin'ny E9.5, SPECC1L (sary 4K, N) dia voaloto mafy ny fifindra-monina CNCC miaraka amin'ny AP2A (sary 4L, M) na SOX10 (sary 4O, P).
(A) Fanehoan-kevitra momba ny totozy Specc11 izay mampiseho ny fampidirana vector decoy ao amin'ny ES DTM096 (intron 1) sy RRH048 (intron 15) klones sela.(BD) lacZ fandokoana ny embryon heterozygous Specc1lDTM096 maneho ny fanehoana Specc1l manomboka amin'ny E8.5 ka hatramin'ny E10.5.NE = neuroectoderm, NF = neural fold, PA1 = andohalambo pharyngeal voalohany.(EP) SPECC1L immunostaining miaraka amin'ny marika NCC AP2A sy SOX10 ao amin'ny valan-javaboary E8.5 (NF; EJ) ary ny fizarana karandoha E9.5 (KP).Ny fandokoana SPECC1L dia hita be dia be tao amin'ny vala neural E8.5 (E, H; zana-tsipìka), anisan'izany ny sela misy marika AP2A (F, G; zana-tsipìka) sy SOX10 (I, J; zana-tsipìka).Ao amin'ny E9.5, SPECC1L dia voaloto mafy ny CNCCs (K, N; zana-tsipìka) misy soratra AP2A (L, M; zana-tsipìka) ary SOX10 (O, P; zana-tsipìka).
Ny fiampitana eo amin'ny totozy Specc1lDTM096/+ sy Specc1lRRH048/+ heterozygous dia mampiseho fa tsy mifameno ny alleles fandrika fototarazo roa ary ny heterozygotes mifangaro sy ny homozygotes embryon ho an'ny allele fandrika fototarazo dia mahafaty embryonika (Table S1).Ny tahan'ny Mendelian dia nanondro ny fihenan'ny taham-pahaveloman'ny heterozygotes amin'ny fahaterahana (nantenaina 1.34 vs. 2.0).Nanamarika ny fahafatesan'ny perinatal ambany izahay teo amin'ny heterozygotes, ny sasany dia nanana anomalies craniofacial (sary S3).Na izany aza, ny fidiran'ny perinatal craniofacial phenotypes ambany dia manasarotra ny fandalinana ny rafitra pathophysiologique fototra.Noho izany dia nifantoka tamin'ny phenotype mahafaty embryonic amin'ny mutant Specc11 homozygous izahay.
Ny ankamaroan'ny heterozygous na homozygous Specc1lDTM096 / RRH048 mutant embryon dia tsy nipoitra taorian'ny E9.5-10.5 (sary 5A-D), ary ny fantsona neural dia tsy nikatona teo aloha (sary 5B, D) ary indraindray mihidy aoriana (tsy aseho) ..Ity kilema fanakatonana fantsona neural cranial ity dia mifandray amin'ny ankamaroan'ny CNCC voamarika DLX2 sisa tavela ao amin'ny vala neural ao amin'ny E10.5, izay manondro ny tsy fisian'ny dissection (sary 5A'-D').Mba hamaritana raha nihena ihany koa ny haben'ny CNCC amin'ny ankapobeny, dia nasiana marika ny tsipika CNCC misy GFP ao amin'ny tsipika fandrika fototarazo miaraka amin'ny Wnt1-Cre sy ROSAmTmG.Nosoratanay ny GFP+ NCC sy ny GFP- (RFP+) tsy NCC avy amin'ny embryon manontolo.Ao amin'ny E9.5, ny ampahany amin'ny CNCCs misy marika GFP voasokajy dia tsy niova be teo amin'ny WT sy ny embryon mutant (tsy aseho), izay manondro ny famaritana CNCC mahazatra.Noho izany, dia nihevitra izahay fa ny sisa tavela Wnt1-Cre sy DLX2 staining ao amin'ny neural vala (sary 5B ') dia noho ny kilema CNCC layering, angamba noho ny fitomboan'ny hakitroky na ny fanaparitahana ny sela AJ, araka ny hita ao amin'ny SPECC1L-kd sela.Nampiasa ny marika NCC izahay SOX10, AP2A, ary DLX2 mba hanamafisana ny fisian'ny CNCC ao amin'ny vala neural (sary 5E-R).Ao amin'ny E8.5, ny fametahana neural fold ho an'ny marika NCC telo dia hita ao amin'ny fizarana WT (sary 5E, G, I) ary Specc1l mutant (sary 5F, H, J).Ao amin'ny E9.5, raha toa kosa ny marika NCC dia nanamarika ny NCC nifindra monina tao amin'ny fizarana WT (sary 5M, O, Q), ny fametahana NCC sisa tavela dia voamarika tao amin'ny vala neural mibaribary amin'ny embryos mutant Specc1l (sary 5N, P, R).Satria ny SOX10 sy DLX2 dia manamarika ny fifindra-monina CNCCs, ity valiny ity dia manondro fa ny SPECC1L-tsy fahampian'ny CNCCs dia mahatratra ny mari-pamantarana taorian'ny fifindra-monina saingy tsy afaka mifindra avy amin'ny vala neural.
Ny tsy fahampian'ny Specc11 dia mitarika amin'ny fanakatonana fantsona neural tsy mety, delamination ny cellules neural crest cranial sy AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryon mitondra ny sela neural crest cranial mifindra monina (CNCC) misy marika Wnt1-Cre (A').Mifanohitra amin'izany kosa, ny embryon mutant Specc11 dia mampiseho ny vala neural misokatra (B), ny zana-tsipìka) ary ny CNCC izay tsy nifindra monina (B', zana-tsipìka).(C, D') Sary an-tsaha mamirapiratra (C, D') sy immunostaining (C', D') amin'ny marika CNCC DLX2 amin'ny embryon E10.5 WT (C, C') ary Specc1l (D, D').Ao amin'ny embryon WT E10.5, ny DLX2-positive CNCC dia manjanaka ny andohalambo (C', zana-tsipìka), raha amin'ny mutants kosa dia mitohy ny fandotoana mibaribary ao amin'ny vala neural misokatra (D', zana-tsipìka) ary ao amin'ny andohalambo pharyngeal voalohany (D', zana-tsipìka).) miaraka amin'ny fandokoana sasany (zana-tsipìka) manondro ny delamination sy ny fifindra-monina ny CNCC.ER) Ny fizarana ny embryon mutant WT sy Specc1l amin'ny dingana E8.5 (E-L) sy E9.5 (M-R) dia nasiana marika amin'ny marika NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) ary DLX2 (I, J, Q, R).Ao amin'ny E8.5, ny staining NCC dia voamarika amin'ny karazana neural fold (NF) sy ny fizarana mutant.Ny co-staining ny SOX10 sy ny β-catenin ao amin'ny E8.5 WT (K) sy ny mutant (L) dia nanambara ny fitomboan'ny β-catenin staining amin'ny sisin'ny sela ao amin'ny vala neural.Ao amin'ny E9.5, dia voamarika ny fandotoana karazana CNCCs (M, O, Q), raha toa kosa amin'ny mutants, ny CNCCs tsy voatanisa dia nanala ny vala neural misokatra (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ famakafakana marika amin'ny fizarana coronal amin'ny embryos WT sy Specc11DTM096/RRH048 miaraka amin'ny mutation E9.5.Aseho eo amin'ny zoro havanana ambony ambony ny fiaramanidina misy fizarana.Ao amin'ny ampahany amin'ny tavy mutant, nitombo ny fandokoana ny F-actin (S, T) sy myosin IIb (U, V).Mitovy amin'ny vokatra in vitro ao amin'ny Fig. 3, amin'ny embryon mutant, dia voamarika ny fandokoana membrane ho an'ny β-catenin (W, X) sy E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) Ny mikrografy elektrôna amin'ny ampahany amin'ny embryon karazana bibidia mijery any ivelan'ny sisin-tanin'ny sela apical-basal dia mampiseho faritra matevina elektrôna miavaka manondro ny fihaonan'ny adhesive (AA, zana-tsipìka).Mifanohitra amin'izany kosa, ao amin'ny fizarana amin'ny embryos mutant Specc11 (BB, zana-tsipìka), ny fihaonan'ny apicobasal manontolo dia matevina elektronika, izay manondro ny fitomboan'ny hakitroky sy ny fanaparitahana ny adhesive junctions.
Mba hitsapana ny hevitsika fa ny fihenan'ny layering dia vokatry ny AJ novaina, dia nandinika ny mari-pamantarana AJ tamin'ny vala neural mibaribary ny embryos mutant Specc1l (sary 5S-Z).Hitanay ny fitomboan'ny fibre actin (sary 5S, T) ary ny fitomboan'ny localization ny myosin IIB staining amin'ny fibre actin (sary 5U, V).Ny tena zava-dehibe dia nahatsikaritra ny fitomboan'ny β-catenin (sary 5W, X) sy E-cadherin (sary 5Y, Z) izahay amin'ny sisin'ny intercellular.Nodinihinay ihany koa ny fametahana β-catenin ny NCC ao amin'ny vala neural amin'ny embryon E8.5 (sary 5K, L).Ny lokon'ny β-catenin dia hita fa matanjaka kokoa ao amin'ny vala neural mutant Specc1l (sary 5L sy K), milaza fa nanomboka ny fiovan'ny AJ.Ao amin'ny micrographs elektronika amin'ny fizarana karandoha amin'ny embryon E9.5, dia nahatsikaritra indray ny fitomboan'ny diffuse electron-dense staining amin'ny embryos mutant Specc1l raha oharina amin'ny WT (sary 5AA, BB ary S1E-H).Raha atambatra, ireo valiny ireo dia manohana ny valin'ny in vitro ao amin'ny sela SPECC1L-kd U2OS ary manoro hevitra fa ny fandokoana AJ aberrant dia mialoha ny stratification CNCC amin'ny embryon mutant.
Raha jerena ny fifandraisana antagonista fantatra eo amin'ny hetsika AKT sy ny fahamarinan-toerana E-cadherin, 17,28 dia nihevitra ny fandraisan'anjaran'ny famantarana PI3K-AKT.Fanampin'izany, dia nahatsikaritra ny fibobohan'ny subepidermal amin'ny sasany amin'ireo embryon mutant izay nandositra ny fahafatesana (<5%) tamin'ny E9.5-10.5 izahay ary nipetraka teo amin'ny manodidina ny E13.5 (sary S3).Ny vesicles subepidermal dia marika famantarana ny fihenan'ny PI3K-AKT mifototra amin'ny PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) dia nitatitra fa ny fanelingelenana ny fampahavitrihana PI3K mifototra amin'ny PDGFRα ao amin'ny embryos mutant PdgfraPI3K / PI3K dia miteraka vesicles subepidermal, tsy fahampian-tsakafo neural, ary phenotypes cleft palate.Raha ny marina, ny haavon'ny pan-AKT sy ny Ser473-AKT phosphorylated mavitrika dia nihena in vivo tao amin'ny tavy mutant Specc1l ho fisamborana embryon E9.5 (sary 6A-D).Ny fihenan'ny haavon'ny phosphorylated Ser473-AKT dia mety ho vokatry ny fihenan'ny haavon'ny pan-AKT in vivo (sary 6E) sy in vitro (sary 6F).Ny fihenan'ny in vitro dia tsy hita afa-tsy rehefa nifandona mafy ny sela U2OS tamin'ny fiovan'ny endriky ny sela sy ny haavon'ny AJ (sary 6D).Noho izany, ny angon-drakitray dia manoro hevitra fa ny SPECC1L dia mpandrindra tsara ny PI3K-AKT famantarana amin'ny morphogenesis craniofacial.
(A-E) E8.5 (A, B) sy E9.5 (C, D) fizarana karandoha na E9.5 lysates avy amin'ny Specc1l mutant embryos (E) mampiseho ny haavon'ny phosphorylated mavitrika S473-AKT sy ny fihenan'ny proteinina pan-AKT , raha ampitahaina amin'ny fanaraha-maso WT.Ny famafazana tandrefana dia natao tamin'ny lysate karazana bibidia sy lysate mutant ao anatin'ny fepetra mitovy.Ny sary naseho ho an'ny SPECC1L dia nalaina tamina blot iray.Io blot io ihany dia nesorina ary nodinihina indray tamin'ny anti-pan-ACT sy β-actin antibody.Ny haavon'ny Pan-AKT ao amin'ny vala neural E8.5 (A, B) sy ny haavon'ny phosphorylated S473-AKT ao amin'ny fizarana karandoha E9.5 dia nihena be.(F) Ny haavon'ny Pan-AKT dia nihena toy izany koa tamin'ny lysates ny sela SPECC1L-kd U2OS voaangona tamin'ny fifandonana avo.Ny baoritra diso dia maneho SEM avy amin'ny fatran'ny tandrefana tsy miankina telo.(GJ) Fizarana amin'ny embryon WT amin'ny E9.5 voaloko miaraka amin'ny KI67 sy ny caspase 3, izay mampiseho ny fihanaky ny sela (G, G ') ary ny hetsika apoptotika kely (H, H ').Ny embryon mutant Specc11 dia mampiseho ny fihanaky ny sela (I), saingy mitombo be ny isan'ny sela mandalo apoptose (J).
Avy eo dia nandinika ireo marika miparitaka sy apoptose izahay.Tsy nahita fahasamihafana izahay tamin'ny fihanaky ny embryon E9.5 (sary 6E, G raha ampitahaina amin'ny I) miaraka amin'ny index proliferation 82.5% ho an'ny mutant WT ary 86.5% ho an'ny mutants Specc1l refesina amin'ny fandokoana KI67 (p <0.56, Fisher's fitsapana marina).Toy izany koa, tsy nahita fahasamihafana eo amin'ny apoptose isika amin'ny alàlan'ny fametahana ny caspase 3 voapetaka amin'ny vala neural amin'ny E8.5 mandra-pahatongan'ny fisamborana embryon (tsy aseho) (tsy aseho).Mifanohitra amin'izany, ny apoptose dia nitombo be tamin'ny embryos mutant E9.5 rehetra (sary 6F, H ary J).Ity fitomboana ankapobeny amin'ny apoptose ity dia mifanaraka amin'ny fihenan'ny PI3K-AKT famantarana sy ny fahafatesan'ny embryonic voalohany29,30,31.
Manaraka, mba hanamafisana ny andraikitry ny PI3K-AKT famantarana amin'ny fiovan'ny AJ ao amin'ny sela kd, dia nanova ny lalan'ny fanaraha-maso sy ny sela kd izahay (sary 7A-F).Nampiasainay ho marika ny endriky ny fiovan'ny sela hita ao amin'ny sela SPECC1L-kd mitambatra, izay nohararaotinay tamin'ny fampiasana ny tahan'ny refy lava indrindra (lava) amin'ny refy mitsangana (sakany).Ny tahan'ny 1 dia antenaina ho an'ny sela somary boribory na cuboidal (sary 7G).Ankoatra ny endriky ny sela, dia nanamafy ihany koa ny fiantraikan'ny AJ amin'ny fametahana β-catenin (sary 7A'-F').Ny fanakanana ny lalana PI3K-AKT amin'ny fampiasana wortmannin dia ampy hanovana ny endriky ny sela amin'ny sela fanaraha-maso (sary 7A, C) sy AJ (sary 7A ').Ny mpikatroka PI3K-AKT SC-79 dia tsy misy fiantraikany amin'ny endriky ny sela (sary 7A, E) na ny fanitarana AJ (sary 7A ') amin'ny sela fanaraha-maso.Ao amin'ny sela SPECC1L-kd, ny fanafoanana bebe kokoa ny lalan'ny PI3K-AKT dia nitombo ny apoptose (sary 7B, D) ary ny fitomboan'ny β-catenin staining (sary 7B '), mifanaraka amin'ny mutants mavesatra ao amin'ny vivo.Ny tena zava-dehibe, ny fampahavitrihana ny lalan'ny PI3K-AKT dia nanatsara ny endriky ny sela (sary 7B, F) sy ny phenotypes AJ (sary 7B ").Ny fiovan'ny endrik'ny sela dia nofaritana ho toy ny tahan'ny fihodinan'ny sela (CCR) ary ampitahaina amin'ny dikany araka ny voalaza etsy ambony (sary 7G).Raha ny marina, ao amin'ny sela fanaraha-maso (sary 7G, CCR = 1.56), ny fitsaboana wortmannin dia ampy hanovana ny endriky ny sela (sary 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) mitovy amin'ilay voamarika. Vidin'ny SPECC1L.-kd sela (sary 7G, CCR = 3.46).Ny fitsaboana Wortmannin amin'ny sela SPECC1L-kd (sary 7G, CCR = 3.60, azo tsinontsinoavina) dia tsy manan-danja kokoa noho ny sela kd tsy voatsabo (sary 7G, CCR = 3.46, azo tsinontsinoavina) na sela fanaraha-maso wortmannin (sary 7G)., CCR = 3.46, tsinontsinona) dia misy fiantraikany amin'ny fanitaran'ny sela (7G, CCR = 3.61, tsinontsinona).Ny tena zava-dehibe, ny mpikatroka SC-79 AKT dia namerina ny phenotype lava amin'ny sela SPECC1L-kd (sary 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Ireo vokatra ireo dia manamafy fa ny SPECC1L dia manara-maso ny famantarana PI3K-AKT ary manoro hevitra fa ny fihenan'ny SPECC1L amin'ny antonony dia misy fiantraikany amin'ny fidiran'ny sela, raha toa kosa ny fihenan'ny apoptosis (sary 8).
(A-F') Control (A, C, E) sy SPECC1L-kd (B, D, F) sela voatsabo amin'ny PI3K-AKT lalan-drivotra wortmannin (C, D) na SC-79 activator (E, F) Fitsaboana .Ny sela fanaraha-maso tsy voatsabo dia cuboidal (A) miaraka amin'ny fandotoana sela β-cat mahazatra (A'), raha ny sela kd kosa dia lava (B) miaraka amin'ny fitomboan'ny β-cat (B').Taorian'ny fanafoanana ny lalan'ny PI3K-AKT, ny sela mifehy ny sela (C) miaraka amin'ny fanitarana β-cat (C'), raha ny sela kd kosa dia nanomboka niharan'ny apoptose (D), mitovy amin'ny embryon tena niova be ary mampiseho β-cat tena mihatsara.fandokoana (D').Taorian'ny fampahavitrihana ny lalana PI3K-AKT, ny sela fanaraha-maso dia nijanona cuboidal (E) ary nanana β-cat (E') mahazatra, raha ny sela kd kosa dia nanatsara ny endriky ny sela (F) sy ny β-cat (F'), izay manondro (G) Ny haavon'ny fiovaovan'ny sela ao amin'ny (AF) dia nofaritana tamin'ny fampiasana ny tahan'ny fihodinan'ny sela (CCR) amin'ny refy lava indrindra (lava) sy ny refy mitsangana (sakany) mifanaraka amin'ny fampiasana rindrambaiko MetaMorph.Ny sela SPECC1L-kd tsy voatsabo (NT) (CCR = 3.46) dia lava kokoa noho ny sela mifehy (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Ny fanakanana an'i Wort amin'ny lalan'ny PI3K-AKT ao amin'ny sela fanaraha-maso dia ampy hahatonga ny elongation mitovy amin'ny endrika sela (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Toy izany koa, ny fampahavitrihana ny AKT nataon'ny SC-79 ao amin'ny sela SPECC1L-kd dia namerina ny fanitarana ny sela mba hifehezana ny haavony (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Ny fitsaboana Wortmannin amin'ny sela SPECC1L-kd dia nitombo ny apoptose saingy tsy nisy fitomboana bebe kokoa tamin'ny fiovan'ny sela (CCR = 3.60) raha oharina amin'ny kd tsy voatsabo (CCR = 3.46, ns) na ny sela fanaraha-maso voatsabo amin'ny wortmannin (3.61).ns = tsy maninona.+/- Ny fandrefesana SEM ho an'ny sela 50 dia aseho.Ny fahasamihafan'ny statistika dia nokajiana tamin'ny fampiasana ny t-test an'ny mpianatra.
(A) Fanehoan-kevitra momba ny fanakanana sy fampahavitrihana ny lalan'ny PI3K-AKT izay miteraka fiovan'ny AJ sy famonjena.(B) Modely atolotra ho an'ny fanamafisana ny proteinina AKT amin'ny SPECC1L.
Ny CNCCs premigratory dia mitaky ny AJ lysis mba hisaraka amin'ny sela neuroepithelial neural anteriora 1,15,32.Ny fitomboan'ny fandotoana ny singa AJ sy ny fahaverezan'ny fizarana asymmetrika apical-basal AJ ao amin'ny sela tsy ampy SPECC1L na in vitro sy in vivo, miaraka amin'ny akaiky ara-batana SPECC1L amin'ny β-catenin, dia manoro hevitra fa ny SPECC1L dia miasa mba hitazonana ny fahamarinan-toerana AJ eo an-toerana. hozatra fandaminana.cytoskeleton actin.Ny fikambanan'ny SPECC1L miaraka amin'ny cytoskeleton actin sy β-catenin ary ny fitomboan'ny isan'ny filaments actin condensed amin'ny tsy fisian'ny SPECC1L dia mifanaraka amin'ny fitomboan'ny haavon'ny AJ.Ny mety ho iray hafa dia ny fitomboan'ny fibra actin ao amin'ny sela tsy ampy SPECC1L dia mitarika fiovana eo amin'ny fihenjanana intercellular.Satria misy fiantraikany amin'ny dinamika AJ 33 ny fihenjanan'ny sela, ny fiovan'ny voltora dia mety hiteraka AJ 34 miparitaka kokoa.Noho izany, ny fiovana rehetra dia hisy fiantraikany amin'ny sosona CNCC.
Ny Wnt1 dia aseho ao amin'ny vala neural tany am-boalohany izay miteraka sela crest neural.Noho izany, ny fanaraha-maso ny tsipika Wnt1-cre dia manamarika ny NCC35 mialoha sy nifindra monina.Na izany aza, ny Wnt1 dia manamarika ihany koa ny clones tadin'ny atidoha dorsal izay azo avy amin'ny vala neural tany am-boalohany 35,36, ka azo inoana fa ny fandokoana ny mutant E9.5 ho an'ny marika Wnt1 amin'ny vala neural misokatra dia tsy CNCC.Ny fandokoana tsara ho an'ny marika NCC AP2A sy SOX10 dia nanamafy fa ny vala neural amin'ny embryon mutant Specc11 dia tena misy CNCC.Ankoatr'izay, satria ny AP2A sy SOX10 dia marika amin'ny NCC mifindra monina tany am-boalohany, ny loko tsara dia manondro fa ireo sela ireo dia CNCC taorian'ny fifindra-monina izay tsy azo fehezin'ny E9.5.
Ny angon-drakitray dia manoro hevitra fa ny fitsipiky ny molekiola AJ amin'ny SPECC1L dia manelanelana amin'ny famantarana PI3K-AKT.Ny famantarana AKT dia mihena amin'ny sela sy tavy tsy ampy SPECC1L.Fikarohana nataon'i Fantauzzo et al.manohana anjara mivantana amin'ny famantarana PI3K-AKT amin'ny morphogenesis craniofacial.(2014) dia naneho fa ny tsy fisian'ny fampahavitrihana ny famantarana PI3K-AKT mifototra amin'ny PDGFRα dia mitarika amin'ny phenotype cleft palate.Asehontsika ihany koa fa ny fanakanana ny lalana PI3K-AKT dia ampy hanovana ny AJ sy ny endriky ny sela ao amin'ny sela U2OS.Mifanaraka amin'ny zavatra hitanay, Kain et al.37 dia naneho fa ny fihenan'ny subunit PI3K α110 ao amin'ny sela endothelial dia miteraka fitomboana mitovy amin'ny fametahana β-catenin pericellular, izay antsoina hoe fitomboan'ny "fanondrom-pifandraisana".Na izany aza, ao amin'ny sela endothelial izay efa voalamina tsara ny filaments actin, ny fanafoanana ny lalan'ny PI3K-AKT dia miteraka endrika sela malalaka.Mifanohitra amin'izany kosa, ny sela SPECC1L-kd U2OS dia nampiseho endrika sela lava.Mety ho karazana sela manokana io fahasamihafana io.Raha misy fiantraikany maharitra amin'ny cytoskeleton actin ny fanafoanana ny famantarana PI3K-AKT, ny fiantraikany amin'ny endriky ny sela dia voafaritra amin'ny fiovan'ny fihenjanana vokatry ny fiovan'ny hakitroky sy ny fandaminana ny fibre actin afovoany.Ao amin'ny sela U2OS, ny fiovan'ny endrik'ny sela ihany no nampiasanay ho marika amin'ny fiovan'ny AJ tsy ampy SPECC1L sy ny fanarenana.Ho fehin-kevitra, mihevitra izahay fa ny fanakanana ny lalan'ny AKT amin'ny tsy fahampian'ny SPECC1L dia mampitombo ny fahamarinan'ny AJ ary mampihena ny delamination ao amin'ny CNCC.
Mahaliana fa ny haavon'ny pan-AKT dia nihena in vitro sy in vivo ho fanampin'ny haavon'ny phosphorylated 473-AKT amin'ny tsy fisian'ny SPECC1L, manoro hevitra ny fanaraha-maso ny famantarana PI3K-AKT amin'ny haavon'ny fitoniana proteinina AKT na ny fihodinana.Ny fototarazo SPECC1L sy MID1, izay samy mifandray amin'ny aretin'i Opitz/GBBB, dia mametraka proteinina izay mampitombina ny microtubule 18,22.Ny mekanika izay ahafahan'ny SPECC1L sy MID1 manelanelana ny fanamafisana ny microtubule dia tsy takatra tanteraka.Amin'ny tranga SPECC1L, ity fanamafisana ity dia ahitana acetylation nohatsaraina amin'ny ampahany amin'ny microtubule 18.Azo atao ny mampiasa mekanika mitovy amin'izany ny SPECC1L mba hampitony ny proteinina hafa toa ny AKT.Naseho fa ny acetylation ny sisa tavela amin'ny lysine ao amin'ny proteinina AKT dia mitarika amin'ny fihenan'ny toerana misy ny membrane sy ny phosphorylation38.Ankoatr'izay, ny ubiquitination ny rojo K63 amin'ny sisa lysine mitovy amin'ny AKT dia takiana amin'ny fametrahana ny membrane sy ny fampahavitrihana39,40.Anisan'ireo anton-javatra maromaro mifandray amin'ny proteinina SPECC1L fantatra amin'ny sehatra avo lenta avo roa heny, efatra - CCDC841, ECM2942, APC ary UBE2I43 - dia voarohirohy amin'ny fihodinan'ny proteinina na ny fitoniana amin'ny alàlan'ny ubiquitination na sumoylation.Ny SPECC1L dia mety ho tafiditra amin'ny fanovana taorian'ny fandikana ny sisa tavela amin'ny lysine AKT, izay misy fiantraikany amin'ny fahamarinan'ny AKT.Na izany aza, ny anjara asa manan-danja amin'ny SPECC1L amin'ny fametrahana sy ny fahamarinan'ny proteinina AKT dia mbola hazavaina.
Ny lesoka mahery vaika amin'ny fanehoana SPECC1L ao amin'ny vivo dia nahatonga ny fandotoana marika AJ sy ny overlay CNCC diso, ary koa ny fitomboan'ny apoptose sy ny fahafatesan'ny embryonika tany am-boalohany.Ny tatitra teo aloha dia naneho fa ny mutants amin'ny totozy miaraka amin'ny haavon'ny apoptose dia mifandray amin'ny tsy fahampian-tsakafo neural 44,45,46,47 sy craniofacial defects48.Misy soso-kevitra fa ny fahafatesan'ny sela be loatra ao amin'ny vala neural na ny andohalambo pharyngeal dia mety hiteraka tsy fahampian'ny sela ilaina amin'ny hetsika morphogenetic mety 48,49,50.Mifanohitra amin'izany kosa, ny tsipika tsy fahampian'ny SPECC1L miaraka amin'ny fitenenana SPECC1L mihena tsikelikely dia tsy nampiseho afa-tsy fiovana AJ tsy nisy porofo nitombo ny fahafatesan'ny sela.Na izany aza, ny fanakanana simika ny lalan'ny PI3K-AKT ao amin'ireo sela Kd ireo dia niteraka apoptose.Noho izany, ny fihenan'ny antonony amin'ny fanehoana na ny fiasa SPECC1L dia miantoka ny fahaveloman'ny sela.Izany dia mifanaraka amin'ny fandinihana fa tsy fahita firy Specc11 mutant embryos izay afa-mandositra ny fisamborana tamin'ny St.E9.5—angamba noho ny fihenan'ny fahaiza-misambotra ny fototarazo—dia afaka manidy ny fantsona neural azy ary mijanona any aoriana any amin'ny fivoarana, matetika miaraka amin'ny kilema craniofacial (sary S3).Mifanaraka amin'izany ihany koa ny fisehoana tsy fahita firy amin'ny embryon Specc1l heterozygous miaraka amin'ny tsy fetezan'ny craniofacial — angamba noho ny fitomboan'ny fahombiazan'ny fisamborana fototarazo-ary koa ny fahitana amin'ny trondro zebra izay misy ny iray amin'ireo orthologues SPECC1L roa (specc1lb) mahatonga ny phenotypes embryon tara, anisan'izany ny fahaverezan'ny embryon. ny valanorano ambany sy ny tseky bilateral51.Noho izany, ny fiovan'ny heterozygous SPECC1L dia mety hiteraka fahasimbana kely amin'ny fiasan'ny SPECC1L mandritra ny morphogenesis craniofacial, ampy hanazavana ny clefts orofacial.Ny fifehezana SPECC1L mifototra amin'ny fifandraisana intercellular dia mety mitana anjara toerana amin'ny palatogenesis sy ny fampifangaroana ny andohalambo pharyngeal.Ny fandalinana fanampiny momba ny fiasan'ny SPECC1L dia hanampy amin'ny fanazavana ny anjara asan'ny fifandraisana intercellular vonjimaika ao amin'ny CNCC mandritra ny fanakatonana fantsona neural amin'ny motility sela neuroepithelial sy ny morphogenesis craniofacial.
Ny fanaraha-maso ny osteosarcoma U2OS sy ny sela SPECC1L-kd dia efa nofaritana teo aloha (Saadi et al., 2011).Ny antibody manohitra ny SPECC1L dia efa voamarika teo aloha (Saadi et al., 2011).Antibody anti-β-catenin (bitro; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (totozy; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspase 3 (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ary β-actin (1: 2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dia nampiasaina araka ny voalaza..Ny filaments actin dia nolokoina tamin'ny Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Ny selan'ny fanaraha-maso U2OS sy ny sela SPECC1L-kd dia novolavolaina tao amin'ny DMEM glucose avo lenta izay nampiana serum bovine 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Ho an'ny fiovan'ny AJ, ny sela 2 x 105 dia nafafy tamin'ny vera notsaboina tamin'ny gelatine porcine 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ary nijery ny fiovan'ny endriky ny sela.Ny sela dia nangonina amin'ny fotoana voafaritra voafaritra: 4 ora aorian'ny famafazana (t = 1), 24 ora aorian'ny famafazana (t = 2), confluence tsy misy fiovana amin'ny endriky ny sela (t = 3), fiovana amin'ny endriky ny sela (t = 4) , 24 ora aorian'ny fiovan'ny sela (t = 5) ary 48 ora aorian'ny fiovan'ny sela (t = 6) (sary 1, 2, 3).Mba hanovana ny lalan'ny PI3K-AKT, ny sela dia novolavolaina tamin'ny fifantohana voatondro miaraka amin'ny PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) na SC-79 mpikatroka (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Ovaina isan'andro ny fitaovana misy ireo akora simika.
Natao tamin'ny fanaraha-maso mivantana sy ny sela KD ao anatin'ny toe-piainana ara-kolontsaina mahazatra ny fandraketam-peo, ary ny sary mifanohitra amin'ny dingana dia angonina isaky ny 10 minitra mandritra ny 7 andro.Ny sary dia azo tamin'ny alàlan'ny microscope inverted Leica DM IRB fehezin'ny solosaina misy dingana mekanika ary tanjona 10 × N-PLAN mifandray amin'ny fakantsary QImaging Retiga-SRV.Nandritra ny fakana sary, ny kolontsaina sela dia voatazona amin'ny 37 ° C ao anaty atmosfera mando miaraka amin'ny 5% CO2.
Ny tsipika cellule ES fandrika fototarazo roa DTM096 sy RRH048 avy amin'ny Foiben'ny Resource Mutant Mouse Resource (UC Davis, CA) dia nampiasaina mba hamoronana tsipika totozy tsy ampy Specc11, voatondro Specc1lgtDTM096 sy Specc1lgtRRH046.Raha fohifohy, ny sela 129 / REJ ES dia nampidirina tao amin'ny blastocysts C57BL6.Ny totozy lahy chimeric vokatr'izany dia nokolokoloina tamin'ny totozy C57BL6 vavy mba hamantarana ny taranaka misy lokon'ny akanjo agouti.Ny fisian'ny fampidirana vector fandrika fototarazo dia nampiasaina hamantarana ny heterozygotes.Ny totozy dia notazonina tamin'ny 129 / REJ; C57BL6.Ny toerana misy ny toerana fampidirana ny vector fandrika fototarazo dia nohamafisin'ny RT-PCR, ny fizotry ny génétique, ary ny famenoana fototarazo (sary fanampiny 1).Mba hanaraha-maso ny fizotry ny CNCC amin'ny totozy Specc1lGT heterozygous roa, ROSAmTmG (#007576) ary Wnt1-Cre (#003829) totozy (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) dia niampita mba hamokarana ny ROSAmTmG sy Wnt1-Cre allele amin'ny embcryosl mutant.Ny fanandramana rehetra amin'ny totozy dia natao araka ny protocols nankatoavin'ny Komitin'ny Fikarakarana sy Fampiasana Biby Institutional ao amin'ny University of Kansas Medical Center.
Ny embryon dia napetraka ao amin'ny (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) mandritra ny 60 min amin'ny mari-pana amin'ny efitrano.Taorian'ny fametrahana ny X-gal staining solution (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) Ny fampandrosoana ny tasy dia natao tamin'ny 37 ° C. .°C ao anatin'ny 1-6 ora.Ny embryon dia napetraka tao amin'ny 4% PFA ary azo jerena.
Ho an'ny blotting tandrefana, ny cellule dia lysed amin'ny buffer lysis passive (Promega, Fitchburg, WI) nampian'ny fifangaroan'ny HALT protease inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates dia nokarakaraina tamin'ny 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX efa vita gels (Bio-Rad, Hercules, CA) ary nafindra tany amin'ny Immobilon PVDF membranes (EMD Millipore, Billerica, MA).Ny membranes dia voasakana amin'ny ronono 5% ao amin'ny PBS misy 0.1% Tween.Ny antibiôsy dia natsipy nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C na adiny iray tamin'ny mari-pana.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) dia nampiasaina tamin'ny famokarana famantarana.Ho an'ny immunostaining, ny embryon dia napetraka mandritra ny alina ao amin'ny 4% PFA / PBS ary cryopreserved.Ny cryosections tissue dia nosakanana tao amin'ny PBS izay misy serum osy mahazatra 1% (Thermo Scientific, Waltham, MA) ary 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ary avy eo dia natsofoka tao amin'ny 4 ° C tao anaty incubator nandritra ny fotoana. alina.miaraka amin'ny anti-antibody sy antibody faharoa fluorescent (1:1000) mandritra ny adiny 1 amin'ny 4 ° C.Ny fizarana voapoizina dia napetraka tao amin'ny mediam-bolamena ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) ary ny sary fisaka dia azo tamin'ny alàlan'ny microscope confocal Leica TCS SPE.Ny immunostaining tsirairay dia natao ho fanandramana tsy miankina telo amin'ny cirossections amin'ny embryon mutant roa farafahakeliny.Andrana misolo tena no aseho.
Ny sela dia natsipy tao anaty buffer RIPA novaina (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, ary HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Raha fohifohy, ny lysate dia nodiovina mialoha tamin'ny proteinina G magnetika vakana (Life Technologies, Carlsbad, CA) ary avy eo dia natsipy nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C. miaraka amin'ny anti-SPECC1L na proteinina IgG proteinina vakana G dia nampiasaina mba hanesorana ny SPECC1L ary ny famafazana tandrefana dia natao tamin'ny fampiasana ny anti-SPECC1L. -β-catenin antibody voalaza etsy ambony Ny andrana co-IP aseho dia solontenan'ny andrana tsy miankina efatra.
Ny sela kolontsaina raikitra na tavy embryonika totozy dia nomena ny foibe microscopy elektronika ao amin'ny University of Kansas Medical Center.Fohy ny santionany dia napetraka tao amin'ny EMbed 812 resin (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerized nandritra ny alina tamin'ny 60 ° C, ary nozaraina tamin'ny 80 nm mampiasa ultramicrotome Leica UC7 misy diamondra.Ny fizarana dia nojerena tamin'ny alàlan'ny mikraoskaopy elektronika fifindran'ny JEOL JEM-1400 misy basy 100 kV Lab6.
Ahoana ny fitanisana ity lahatsoratra ity: Wilson, NR et al.Ny tsy fahampian'ny SPECC1L dia mitarika amin'ny fitomboan'ny fitoniana amin'ny tonon-taolana sy ny fihenan'ny delamination ny sela crest neural cranial.ny siansa.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induction sy fanavahana ny crest neural.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Cranial neural crest cell in motion: ny anjara asany amin'ny fivoaran'ny craniofacial.American Journal of Medical Genetics.Fizarana A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: ny fitomboany sy ny fivoarany nandritra ny 20 taona.Pediatrician.patolojia.laboratoara.fanafody.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ary Noten MM Breakthrough amin'ny génétique amin'ny clefts orofacial.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ary Riley, FM Molecular mekanika amin'ny fifindran'ny sela neural crest cranial sy ny modely mandritra ny fivoaran'ny craniofacial.Fampandrosoana 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH, Murray, JK Cleft molotra sy lanilany: fahatakarana ny fiantraikan'ny fototarazo sy ny tontolo iainana.fanehoan-kevitra voajanahary.Genetika 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Ny morphogenesis tsy ara-dalàna amin'ny hoditra, ny rantsambatana, ary ny faritra craniofacial ao amin'ny interferon-regulating factor-6 (Irf6) -tsy ampy totozy.National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Ny fiovan'ny toetr'andro ao amin'ny GRHL3 dia miteraka aretina van der Waord ary manimba ny fivoaran'ny periderm am-bava.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ary Juriloff, DM Fanavaozana ny lisitry ny mutant totozy misy lesoka amin'ny fanakatonana fantsona neural ary mandroso mankany amin'ny fahatakarana fototarazo feno momba ny fanakatonana fantsona neural.Fanadihadiana momba ny fahaterahana.Fizarana A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling dia mifehy ny fahavelomana sy ny fitomboana amin'ny fivoaran'ny skeletal amin'ny alàlan'ny p53 miankina amin'ny intracellular lalana.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ary Murdoch, JN Disheveled: Fifandraisana amin'ny fanitarana convergent amin'ny fanakatonana fantsona neural.Trends amin'ny neurology.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).