347 Stainless vy coiled Tubing singa simika, Famantarana ny vaovao interferon mamaly ny olombelona leukocyte antigen-A (HLA-A) chaperone proteinina mampiasa cross-linked mass spectrometry (CLMS)

Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Mampiasa kinova mpitety tranonkala manana fanohanana CSS voafetra ianao.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Ho fanampin'izany, mba hiantohana ny fanohanana mitohy, dia asehoy ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript.
Sliders mampiseho lahatsoratra telo isaky ny slide.Ampiasao ny bokotra aoriana sy manaraka mba hivezivezena amin'ny slides, na ny bokotra mpanara-maso ny slides amin'ny farany mba hivezivezena amin'ny slide tsirairay.

Mombamomba ny vokatra

Stainless Steel 347L Coil Tubes, Steel Grade: SS347L

Ny rafi-pandrefesana interferon dia miteraka valim-pandrenesana cytokine matanjaka amin'ny karazana famantarana pathological pathogenic sy intrinsic avy amin'ny tontolo iainana, ka miteraka ny fampidirana proteinina interferon-inducible.Nampiasa DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) izahay mba hamantarana ny fifandraisana proteinina-proteinina vaovao ao amin'ny sehatry ny proteinina interferon.Ho fanampin'ny proteinina interferon-inducible antenaina, dia namantatra ihany koa ny fampidirana intermolecular sy intramolecular cross-linked amin'ny proteinina interferon-inducible kanônika toy ny MX1, USP18, OAS3, ary STAT1.Nifantoka tamin'ny fanamarinana orthogonal ny tamba-jotra proteinina interferon-inducible novolavolain'ny proteinina HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) izahay amin'ny fampiasana co-immunoprecipitation sy ny fandalinan'izy ireo bebe kokoa amin'ny fampiasana modely molecular dynamics.Ny modely amin'ny dinamika conformational amin'ny complex proteinina dia nanambara tranokala fifaneraserana maromaro izay naneho ny fifandraisana hita tao amin'ny fikarohana CLMS.Miara-manolotra fanadihadiana momba ny CLMS izahay mba hamantarana ireo complexe famantarana vaovao ateraky ny interferon, ary miandrandra ny fampiasana bebe kokoa ny CLMS mba hamantarana ny dinamika vaovao amin'ny fifandraisan'ny proteinina ao amin'ny microenvironment tumor.
Alohan'ny hanombohan'ny valim-piarovan'ny hery fanefitra, ny rafi-piarovana voajanahary ao amin'ny mpampiantrano dia mametraka valinteny antimikrobia mpanelanelana amin'ny fianakavian'ny cytokine alpha-helical miafina antsoina hoe interferon (IFNs).Ny kilasy IFN karazana IFNα sy IFNβ dia manetsika ny valin'ny sela, anisan'izany ny antiviral, proapoptotic, proinflammatoire, ary antiproliferative fanjakana.Ao amin'ny olombelona dia fantatra ny karazana IFNα 13, izay mivondrona ao amin'ny chromosome 91. Mahagaga fa ny IFNα2 ihany no nodinihina ho an'ny fampiasana klinika.Vao haingana, nojerena manokana ny fikarohana momba ireo karazana IFNα hafa.Ny fanadihadiana vao haingana dia naneho fa ny IFNα14 dia iray amin'ireo isoforma mahomby indrindra amin'ny famerana ny famerenana ny HBV2 sy ny VIH-13,4 raha oharina amin'ny subtype kanonika IFNα2.
Voamarina fa ny karazana interferon receptor complexes (IFNAR1 sy IFNAR2) dia miteraka cascade transduction signal izay tarihin'i Janus kinases TYK2 sy JAK15,6.Ireo Janus kinases phosphorylate signal transducers sy transcriptional protein activators (STAT1 sy STAT2) amin'ny tyrosine residues mba hanombohana SH2 domain-mediated heterodimerization6.Avy eo, ny IRF9 dia mamatotra ny heterodimer STAT mba hamorona complexe trimeric an'ny IFN-stimulated factor 3 gene (ISGF3), izay mandika ny nucleus ary mampirisika ny fandikana ny 2000 interferon-stimulated genes (ISGs) 5,6,7,8.
Ny ISG dia mandrafitra ny taolam-paty amin'ny hery fiarovana voajanahary, indrindra ho setrin'ny fanafihana virosy.Amin'ny maha andalana voalohany amin'ny fiarovana amin'ny otrikaretina virosy, ny sela dia mametraka haingana ny fifandraisana midadasika amin'ny proteinina sela miaraka amin'ny hetsika biolojika isan-karazany.Ireo proteinina ireo dia misy ireo mpandray ny fanekena ny lamina, ny molekiola famantarana, ny anton'ny transcription, ary ny proteinina manana fiasa antiviral mivantana, ary koa ireo mpandrindra ratsy amin'ny valin'ny immune9.Ny ankamaroan'ny fampahalalam-baovao momba ny hetsika ISG dia avy amin'ny efijery miasa amin'ny fampiasana efijery overexpression10,11 na teknika fampanginana ny fototarazo (siRNA, RNAi ary CRISPR)12,13 izay maneho na manakana ny ISG tsirairay ary andrana amin'ny viriosy isan-karazany ny asany.Na dia namaritra ny fananana antiviral an'ny ISG tsirairay aza ireo fanadihadiana ireo, dia mbola tsy fantatra ny mekanika molekiola fototra amin'ny ISG tsirairay.Ekena amin'ny ankapobeny fa proteinina maro no mifandray amin'ny cytokine iray na maromaro mba hiantohana ny asa feno, ka na ny ISG dia mifandray mivantana na ny fifandraisany dia mpanelanelana amin'ny proteinina sela.Ohatra, ny fanadihadiana momba ny proteomika photocrosslinked vao haingana dia namaritra ny ATPase VCP/p97 ho mpiara-miombon'antoka lehibe amin'ny IFITM3, izay mitarika ho amin'ny fahadisoam-panantenana amin'ny fanasokajiana lysosomal, turnover ary cotransport amin'ny IFITM3 miaraka amin'ny poti-virosy 14.Amin'ny fampiasana immunoprecipitation, dia fantatray ny VAPA, proteinina mifandraika amin'ny vesicle, ho mpiara-miombon'antoka amin'ny IFITM1 / 2/3 izay manelanelana ny fahamatoran'ny viriosy amin'ny kolesterola, ary nohamafisin'ny fandalinana iray hafa mampiasa rafitra roa-hybrid leviora.Fanohanana siantifika 15 , 16 .
Ny dingana biolojika fototra tafiditra amin'ny fanafoanana ny otrikaretina sy ny fiovan'ny aretina dia ny fanolorana antigène, izay tarihin'ny molekiola lehibe histocompatibility complex (MHC).Ny peptide (8-12 asidra amino lava) avy amin'ny proteinina voatapaka, tapaka aloha na diso tafahoatra dia ampidirina ao amin'ny heterodimer MHC-I (misy rojo mavesatra sy maivana MHC-I, antsoina hoe β-2-microglobulin; β2M) 17,18.Ireo trimer MHC-I stable vokatr'izany dia entina eny amin'ny selan'ny sela, izay ahitana ny peptides intracellular mankany amin'ny sela T CD8+ (sela T cytotoxic)17.Ny sela T dia mahafantatra sy manimba ireo otrikaretina sy sela mitondra antigène manokana.Noho izany, ny pathogens sy ny sela fivontosana matetika dia manafoana ny fizotran'ny fampisehoana antigène mba hisorohana ny fanaraha-maso ny hery fiarovana.Ankoatr'izay, ny MHC-I dia mihena amin'ny 40-90% amin'ny fivontosana olombelona ary matetika mifandray amin'ny prognosis ratsy kokoa19.
Ny fototarazo mandray anjara amin'ny famaliana otrikaretina dia tsy maintsy mifamadika haingana eo amin'ny toetry ny fialan-tsasatra sy ny toetry ny transcription mavitrika.Noho izany, proteinina sela maromaro no heverina ho tafiditra amin'ny valin'ny fangatahana IFN avo lenta mandritra ny fotoana fohy, anisan'izany ny fanavaozana sy ny fanovana ny chromatin 20,21 promoter.Ny ankamaroan'ny fanadihadiana dia nifantoka tamin'ny famantarana ny mpiara-miasa amin'ny proteinina ISG tsirairay eo anatrehan'ny IFN.Ny fandalinana proteomika sy transcriptomic maro amin'ny rafitra sela modely dia nanazava ny fiantraikan'ny IFN amin'ny tontolon'ny sela.Na izany aza, na dia eo aza ny fitomboan'ny fahatakarana ny dinamika ateraky ny interferon, dia mbola kely ihany no fantatsika momba ny fandraisana anjaran'ny ISG.Rehefa mandinika ny fahasarotana sy ny fihetsehan'ny interferon miankina amin'ny fotoana, dia misy fanontaniana roa mipoitra: (i) azo atao ve ny mampitombina sy mamandrika ireo complexes multiproteinina tafiditra amin'ny fampandrenesana haingana, ary (ii) azo sarihina amin'ny habaka 3D ve ireo fifandraisana ireo?
Mba hamahana ireo olana ireo, dia nampiharina ny succinimide suberate-mediated chimique cross-linking (DSS) miaraka amin'ny mass spectrometry (CLMS) mba handinihana ny tambajotra fifandraisana proteinina IFNα sy ny dinamikany.Ny DSS dia manampy fatorana covalent eo amin'ny sisa tavela amin'ny proteinina sy / na komplex proteinina in vivo.Ny famakafakana MS manaraka dia manambara tranonkala mifamatotra manokana izay maneho ny elanelana misy eo amin'ny faritra ao anatin'ny proteinina iray manokana, antsoina hoe fifandraisana anatiny, na subunit ao amin'ny complexe proteinina, antsoina hoe interrelationships.Amin'ny fampiasana an'io fomba io, dia nahita complexes proteinina-proteinina vaovao sy tambajotra interferon-induced multiprotein izahay.Amin'ny alàlan'ny fitsapana fanampiny amin'ny ampahany amin'ireo fifandraisana vaovao ireo, dia asehontsika fa ny H2BFS (H2B histone-karazana FS; antsoina hoe H2B) ary ny MDN1 dia miasa ho mpiara-miombon'antoka ho an'ny HLA-A.
Ny sela Flo-1 dia iray amin'ireo modely in vitro malaza indrindra amin'ny adenocarcinoma esophageal satria izy ireo dia maka tahaka ireo singa manan-danja amin'ny fivontosana esophageal22,23.Na izany aza, tsy ny fivontosana rehetra dia immunogène, ary mba hamaritana raha mamaly ny fitsaboana interferon ny sela Flo-1, dia nokarakarainay ny sela Flo-1 tamin'ny 10 ng / ml IFNα nandritra ny 72 ora.Ny sela Flo-1 dia nampiseho ny fampidirana pSTAT1 sy IRF1 tany am-boalohany, nanomboka ny ora 2 taorian'ny fitsaboana ary nitohy nandritra ny ora 72, miaraka amin'ny fihenan'ny fotoana miankina amin'ny haavon'ny IRF1 (sary 1A).Ny ISGs (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, ary ISG15) dia hita fa voatarika mafy taorian'ny ora 6, nanahaka ny valin'ny dingana mahazatra sy tara amin'ny IFNα (sary 1A).Ireo angon-drakitra ireo dia manoro hevitra fa ity modely finday ity dia azo ampiasaina handinihana ny valin'ny interferon.
Valiny fanehoana proteinina tsy mitovy amin'ny sela Flo-1 taorian'ny fitsaboana IFNα.(A) Ny fanehoana proteinina ao amin'ny sela Flo-1 voatsabo amin'ny 10 ng / ml IFNα mandritra ny 2, 6, 24, 48 ary 72 ora dia nodinihina tamin'ny immunoblot tamin'ny fampiasana ny antibody ISG voalaza.(B) Coomassie manga miloko SDS-PAGE gel avy amin'ny sela manontolo taorian'ny fifamatorana amin'ny DSS ho an'ny fotoana voatondro sy ny fifantohana.(C) immunoblot solontena nodinihina tamin'ny antibody p53 (DO-1) avy amin'ny santionany mitovy mba hanombanana ny haavon'ny fifamatorana proteinina.
Mba hisamborana ny tontolon'ny fifaneraserana proteinina in situ, dia nampiasa DSS izahay, fitaovana fampifandraisan'anjaran'ny besinimaro be mpampiasa noho ny fahafenoan'ny membrane ambony sy ny fotoana fohy.Ny fe-potoana fanehoan-kevitra fohy kokoa dia manampy amin'ny fisorohana ny fiforonan'ireo fitambarana proteinina mifamatotra lehibe, ka mitazona ny fahamarinan'ny crosslinker.Mba hamaritana ny fifantohana tsara indrindra amin'ny DSS sy hisorohana ny fifamatorana tafahoatra, dia nasehonay voalohany ny sela tamin'ny 5, 2.5, ary 1 mM DSS nandritra ny 5, 10, 5, ary 30 minitra, ary nanadihady ny lysates nataon'i Coomassie-stained SDS-PAGE. (tsy aseho ny angona).Ny lysate sela dia toa mifamatotra mafy amin'ny fifantohana ambany indrindra ary amin'ny fotoana fohy indrindra.Noho izany, ny DSS dia nalaina tamin'ny 1, 0.5, ary 0.1 mM nandritra ny 5 minitra (sary 1B).Ny fifamatorana tsara indrindra dia voamarika tamin'ny 0.5 mM DSS nandritra ny 5 minitra, ary ireo fepetra ireo dia nofidina ho an'ny sela voatsabo amin'ny IFNα.Ankoatr'izay, ny sary 1C dia mampiseho blot tandrefana natao tamin'ny fampiasana ny antibody p53 (DO-1) mba hanombanana ny haavon'ny fifamatorana proteinina.
Ny sela Flo-1 dia notsaboina tamin'ny 10 ng / ml IFNα nandritra ny 24 ora alohan'ny hanampiana ny crosslinker.Ny sela mifamatotra dia nopotehina tamin'ny proteolysis dingana roa ary ny proteinina dia nokarakarain'ny FASP (sary 2)24,25.Ny peptides tryptic mifamatotra dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny spectrometry faobe (sary 2).Ny MS/MS spectra dia ampifandraisina amin'ny filaharan'ny proteinina ary isaina amin'ny MaxQuant26,27.Ny peptides mifandray amin'ny cross-linked dia fantatra avy amin'ny spectra azo tamin'ny alàlan'ny programa SIM-XL, ary ny fitambarana tsirairay dia natambatra ho tambajotra sarotra amin'ny fampiasana ny xQuest28 sy SIM-XL29 open source computing software pipelines (sary 2).Ny SIM-XL dia mamaritra ny fifandraisan'ny proteinina-proteinina, ny rojo anatiny ary ny rojo tsirairay amin'ny fangaro proteinina tsotra na sarotra ary manome sora-baventy ho an'ny fijerena ny fifandraisana amin'ny rafitra proteinina.Ho fanampin'izany, mametraka ny references tsirairay ho isa ID araka ny kalitaon'ny spectrum MS/MS29.Betsaka ny fifandraisana misy proteinina-proteinina azo itokisana sy complexes no fantatra, ary misy andiana fifandraisana vaovao nohadihadiana bebe kokoa amin'ny fampiasana ny co-immunoprecipitation sy ny fiovan'ny conformational amin'ny complexes amin'ny fampiasana molecular dynamics (MD) modeling (sary 2) 30, 31.
Fijerena schematic momba ny fomba CLMS.Ny sela Flo-1 dia notsaboina tamin'ny 10 ng / ml IFNα nandritra ny 24 ora narahin'ny fifandraisana proteinina in situ amin'ny fampiasana DSS arahin'ny lysis sela sy ny trypsinization.Ny santionany mifandray amin'ny cross-link dia nodinihina tamin'ny fampiasana spectrometer faobe Orbitrap ary nalaina santionany ho an'ny fizarazarana ny peptide precursors mandritra ny LC-MS / MS.Peptides roa mifamatotra no fantatra tamin'ny spectra azo tamin'ny alàlan'ny programa Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), ary ny fitambarana rehetra dia natambatra ho tambajotra sarotra amin'ny alàlan'ny pipelines computational.Sivanina ny fifampikasohana ambany fahatokisana mifototra amin'ny naotin'ny tahan'ny tsara diso (FDR).Ny fifaneraserana proteinina-proteinina vaovao marobe dia nohamafisina bebe kokoa tamin'ny fampiasana co-immunoprecipitation, ary ny fiovan'ny conformational ao amin'ny complexes dia nodinihina tamin'ny fampiasana molecular dynamics (MD).
Ny totalin'ny ~ 30,500 sy ~ 28,500 peptides dia hita tamin'ny fampiasana MaxQuant amin'ny santionan'ny IFNα tsy mihetsiketsika sy mamporisika (Tabilao fanampiny S1, sary 3A).Ny fizarana halavan'ny peptide amin'ireo tranga roa ireo dia nampiseho ampahany ambony amin'ny peptides lehibe kokoa, izay manondro ny fisian'ny peptides mifamatotra (sary 3B, C).Ankoatra izany, ny ampahany betsaka amin'ny peptides lehibe kokoa dia hita ao amin'ny 40-55 amin'ny santionany voatsabo IFNα (sary 3C).Ny sarintany proteinina manohitra ny hamafin'ny log2 dia nampiseho fa ny proteinina mahazatra interferon-stimulated no be indrindra raha oharina amin'ny santionany tsy voatsabo, anisan'izany ny MX1, IFIT1 / 3, OAS2 / 3, DDX58, ary HLA-F (sary 3D).Ny famakafakana ny lalana ho an'ny proteinina mihoatra ny avo telo heny ho valin'ny fitsaboana IFNα amin'ny fampiasana ny tahiry Reactome pathway dia nampiseho fa ny fanolorana sy ny fanodinana antigène MHC-I-mediated no lalana manan-danja indrindra (sary 3E).Mifanaraka amin'ny tatitra teo aloha, ny valin'ny antiviral navoakan'ny OAS sy ISG15 ary koa ny famantarana IFNα / β sy cytokine dia anisan'ireo lalana navitrika.Ankoatra izany, ny lysine- sy serine-specific protein cross-links dia fantatra avy amin'ny MS / MS spectra tany am-boalohany tamin'ny fampiasana SIM-XL.Ny fanadihadiana vao haingana dia nitatitra ny ISG 104 mirefy virosy 20 avy amin'ny kilasy virosy 9 tamin'ny alàlan'ny meta-fanadihadiana momba ny fandalinana mihoatra ny ISG tsirairay amin'ny karazana sela 59.Na izany aza, mba handresena ny fetran'ny kajikajy amin'ny fisavana data lehibe, dia nanomboka tamin'ny angona kely kokoa izahay mba hijerena ny fifandraisana mety misy eo amin'ny lisitry ny fototarazo IRDS notaterin'i Padaria et al., izay ISG ny ankamaroany.
Famantarana ireo proteinina mifamatotra amin'ny fomba samihafa ho valin'ny IFNα (angona azo avy amin'ny MaxQuant).(A) Diagram Venn maneho ny isan'ny peptides mahazatra sy manokana hita ao amin'ny santionany Flo-1 voatsabo sy tsy voatsabo IFNα14.Fizarana halavan'ny peptide ny santionany mifamatotra tsy voatsabo (B) sy IFNα voatsabo (C).(D) Sarintanin'ny hafanana maneho ny log2 (ny hamafin'ny LFQ) eo anelanelan'ny sela Flo-1 tsy voatsabo sy IFNα14.Ny tontonana havia dia mampiseho ny proteinina mavitrika indrindra amin'ny fisian'ny IFNα.(E) Histograma maneho ny làlam-pampandrosoana lehibe 20 aorian'ny fitsaboana IFNα.Ny angon-drakitra momba ny lalan'ny Reactome dia nanadihady fiovana mihoatra ny efatra heny amin'ny proteinina mamaly IFNα.
Voarakitra tsara ny fanentanana ISG misy interferon, saingy amin'ny ambaratonga molekiola dia tsy takatry ny saina firy ny fiafaran'ireo proteinina ireo amin'ny asa biolojika isan-karazany.Nanadihady ny fifandraisan'ny proteinina izahay miaraka amin'ny fahatokisana ambony eo amin'ireo ISG fantatra.Mahaliana fa nahita tambajotra misy proteinina MX1, USP18, ROBO1, OAS3, ary STAT1 izahay izay mamorona complexe lehibe ho valin'ny fitsaboana IFNα (sary 4, Table S2) 32,33,34.Ny tena zava-dehibe, ireo fifandraisana ireo dia hita amin'ny triplicates rehetra tsaboina amin'ny IFNα ary tsy hita amin'ny santionany tsy voatsabo, izay milaza fa izy ireo dia niforona manokana ho valin'ny fitsaboana IFNα.Fantatra fa ny transcription STAT1 dia mandrindra ny fanehoana ireo ISG ireo, saingy tsy mbola nianatra ny fifandraisany amin'ny ISG amin'ny haavon'ny proteinina.Ny firafitry ny kristaly STAT1 dia naneho fa ny sehatra helika (CCD) dia tsy tafiditra amin'ny fifandraisana amin'ny ADN na ny protomer mandritra ny fananganana dimers35.Ireo α-helices ireo dia mamorona rafitra helix helika izay manome velaran-tany hydrophilika be indrindra mba hisian'ny fifampikasohana 35 .Ao amin'ny angon-drakitra CLMS, dia nahatsikaritra izahay fa ny ankamaroan'ny fifandraisana amin'ny STAT1 dia nitranga tao amin'ny sehatra SH2 talohan'ny CCD, ny sehatra mpampitohy, na ny rambony C-terminal (sisa 700-708) (sary 4A).Ny fanadihadiana teo aloha dia nitatitra fa ny USP18 dia mifatotra amin'ny CCD sy ADN-binding domain (DBD) an'ny STAT2 ary nalaina tao amin'ny subunit ny karazana I interferon receptor IFNAR2 mba hanelanelana ny fanakanana ny karazana I interferon signaling 24.Ny angon-drakitray koa dia naneho fa ny sehatra catalytic USP18 dia mifandray amin'ny STAT1 DBD (sary 4A, D), izay manoro hevitra fa ny STAT1 sy STAT2 dia mety manana anjara toerana amin'ny fisarihana ny USP18 amin'ny IFNAR2.
Tambajotran'ny proteinina-proteinina ISG hita ao amin'ny sela mifamatotra mifindra amin'ny IFNα.(A) Tetika fifaneraserana 2D mampiseho fifandraisana proteinina-proteinina (voaforona ao amin'ny programa SIM-XL), miaraka amin'ny tsipika maneho fifandraisana intermolecular (cutoff crosslink napetraka amin'ny 3.5).Ny sehatra misy ny maha-samihafa azy dia voamariky ny lokony32: sehatra MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), ary GED (569–660).Sehatra OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), ary OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) sy fn3 (777–864).saha STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), ary STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Mpijery manodidina ny proteinina mifamatotra (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, ary STAT1) miaraka amin'ny fifandraisana sy fifandraisana misy soratra amin'ny manga sy mena.Ny fetran'ny cross-link dia napetraka amin'ny 3.5.Ny teboka dot dia manondro tranokalan'ny fifandraisana STAT1 miaraka amin'ny MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), ary OAS3 (F), ary koa ny tranokalan'ny fifandraisana K na S eo amin'ireo peptides roa.Ao amin'ny sary, ny tokonam-baravarana cross-link dia napetraka ho 3.0.(G) Tranonkala fifaneraserana isan-karazany eo amin'ny sehatra STAT1 sy OAS3 DI napetraka eo amin'ny firafitry ny proteinina ao amin'ny PyMol (rafitra sary molekiola PyMOL, version 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) ary OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programa.
Ny isoforme roa an'ny USP18 dia nofaritana tamin'ny olombelona, ​​​​proteinina feno lava izay hita indrindra ao amin'ny nucleus, ary isoform tsy misy domaine N-terminal, USP18-sf, izay mizara mitovy amin'ny cytoplasma sy ny nucleus 36.Ankoatr'izay, ny N-terminus dia voalaza fa tsy voalamina ary tsy mitaky hetsika isopeptidase na fatorana ISG1537.Ny ankamaroan'ny fifandraisana fantatra amin'ny fianaranay dia hita ao amin'ny N-terminus ny proteinina, izay milaza fa ireo fifandraisana ireo dia misy USP18 (sary 4A, D) ary mety hitranga ao amin'ny nucleus.Ankoatr'izay, ny angon-drakitray dia manondro ihany koa fa ny N-terminus dia manokana amin'ny fifandraisana proteinina amin'ny proteinina.Ny tranokala mifamatotra IFNAR2 dia eo anelanelan'ny sisa tavela 312-368, ary indrindra fa tsy misy proteinina ao amin'ny complexe mifatotra amin'ity faritra ity (sary 4A) 37,38.Ireo angon-drakitra nalaina ireo dia manondro fa ny sehatra mifamatotra IFNAR2 dia ampiasain'ny proteinina mpandray.Ankoatra izany, ny OAS3 sy ROBO1 ihany no hita fa mifandray amin'ny sehatra ambony amin'ny tranokalan'ny N-terminus sy IFNAR2 (sary 4A).
ROBO1 dia an'ny immunoglobulin (Ig) superfamily amin'ny molekiola famantarana transmembrane ary misy sehatra Ig dimy sy sehatra fibronectin (Fn) telo ao amin'ny faritra extracellular.Ireo sehatra extracellular ireo dia arahin'ny faritry ny membrane-proximal ary ny helix transmembrane tokana 39. Ny faritry ny intracellular tsy misy rafitra dia hita ao amin'ny C-terminus ary misy motifs sequence voatahiry izay manelanelana ny fatorana proteinina effector39.Ny faritra manomboka amin'ny asidra amino ~ 1100 ka hatramin'ny 1600 dia mikorontana ny ankamaroany.Hitanay fa ny MX1 dia mifandray amin'ny ROBO1 amin'ny alàlan'ny sehatra Ig, Fn, ary intracellular, raha ny ankamaroan'ny fifandraisana amin'ny STAT1 dia mitranga eo anelanelan'ny CCD, ny sehatra mpampitohy, ary ny C-terminus an'ny ROBO1 (sary 4A, E).Amin'ny lafiny iray, ny fifandraisana amin'ny faritra mpampitohy DI, DIII, ary OAS3 dia nozaraina manerana ny proteinina ROBO1 (sary 4A).
Ny fianakavian'ny proteinina oligoadenylate synthase (OAS) dia manaiky sy mamatotra ny RNA (dsRNA) roa-stranded intracellular, mandalo fiovan'ny conformational, ary mamorona oligoadenylates mifandray amin'ny 2′,5′ (2-5 As) 40.Hita fa eo amin'ireo OAS telo, ny OAS3 dia mampiseho ny fifandraisana ambony indrindra amin'ny dsRNA ary mampifanaraka ny kely indrindra amin'ny 2-5 As, izay afaka manetsika ny RNase L ary mametra ny replication viral 41.Ny fianakaviana OAS dia ahitana ny polymerase beta (pol-β)-toy ny nucleotide transferase domains.Ny fikarohana teo aloha dia naneho fa ny hetsika catalytic amin'ny sehatra C-terminal (DIII) dia miankina amin'ny domaine dsRNA-binding (DI), izay takiana amin'ny fampahavitrihana ny OAS342.Hitanay fa ny sehatra DI sy DII an'ny OAS3 dia mifandray amin'ny CCD ary faritra kely misy eo anelanelan'ny SH2 sy STAT1 TAD (sary 4A, F).Ny fametahana ireo tranokala mifamatotra samihafa amin'ny firafitry ny proteinina dia nanambara ny fifandraisana misy eo amin'ny β-sheet sy ny DBD STAT1 loop ary ny paosy misokatra na ny lavaka miforona amin'ny residues 60-75 ao amin'ny domaine DI an'ny OAS3 (sary 4G).Ny orientation ny proteinina ao amin'ny complex koa dia nanondro fa tsy misy na dia iray aza amin'ny fifandraisana amin'ny OAS3 hanelingelina ny ADN-mamatotra ny ADN ny sehatra DI (sary S1A).Ankoatra izany, ny sehatra N-terminal an'ny GTPase MX1 dia mifandray be dia be amin'ny sehatra DI sy DIII an'ny OAS3 (sary 4A).Hitanay ihany koa ny fifaneraserana eo amin'ny OAS1 sy MX1 amin'ny fiverimberenan'ny IFNα telo, izay misy sehatra OAS1 tokana (mavitrika ihany koa) nifanerasera tamin'ny sehatra MX1 telo (sary S2A, B).
Ny proteinina MX dia ampahany amin'ny fianakaviana lehibe misy GTPases mitovy amin'ny dynein izay misy domaine GTPase N-terminal izay mamatotra sy manodina ny GTP, sehatra mpanelanelana izay manelanelana ny fivorian-tena, ary zipper leucine C-terminal izay miasa toy ny GTPase (LZ). ).domain effector domain25,43.MX1 dia mifatotra amin'ny subunits amin'ny polymerase viraliny mba hanakanana ny fandikana ny fototarazo viral43.Ny efijery roa-hybrid masirasira efa voalaza teo aloha dia nampiseho fa ny MX1 mifandraika amin'ny PIAS1 dia manakana ny fampahavitrihana ny fototarazo mpanelanelana STAT1 amin'ny fanakanana ny asan'ny ADN ary manana hetsika ligase SUMO E344,45.Eto, asehontsika fa ny MX1 dia mifamatotra amin'ny STAT1 (sary 4C, D), na izany aza ny fiantraikan'io fifandraisana io amin'ny fampahavitrihana ny fototarazo STAT1 ho valin'ny IFNα dia mila fandalinana fanampiny.Ankoatr'izay dia hitanay ihany koa fa ny MX1 dia nifanerasera tamin'ny IFIT3 sy DDX60 tamin'ny famerenana telo IFNα (sary S2C).
Ny DDX60 dia helikase cytoplasmic IFN izay efa voalaza teo aloha fa manana anjara toerana amin'ny fanimbana tsy miankina RIG-I amin'ny RNA46 viraliny.Mifandray amin'ny RIG-I izy ary manetsika ny famantarana azy amin'ny fomba manokana ligand 46. Ny DDX60 dia ahitana sehatra helicase DEXD / H-Box ary sehatra helikase C-terminal izay mamatotra ny RNA sy DNA47 viral.Ny ankamaroan'ny fifandraisany amin'ny MX1 sy ny IFIT3 dia mitranga ao anatin'ny faritra lava N- sy C-terminal tsy misy sehatra kanonika na motifs (sary S2E, F).Na izany aza, ny MX1 dia mifandray amin'ny domaine helicase DEXD / H-Box (sary S2E).Ny proteinina ao amin'ny fianakaviana IFIT dia manana dika mitovy amin'ny motif helix-turn-helix miavaka antsoina hoe tetrapeptide repeat (TPR).Ny IFIT3 dia hita fa modulator tsara amin'ny famantarana RIG-I ary noho izany dia singa iray ao amin'ny complex MAVS.Raha atambatra, ny angon-drakitray dia manoro hevitra fa ny IFIT3 sy DDX60 dia mifandray indrindra amin'ny faritra eo anelanelan'ny TPR 3-6 an'ny IFIT3 ary mety manana anjara toerana amin'ny famantarana RIG-I / MAVS (sary S2F).
Raha jerena fa ny fanaovana screening ny proteome manontolo dia mavesa-danja amin'ny fikajiana, avy eo dia nanara-maso ny angon-drakitra UniProt olombelona manontolo izahay noho ny fisian'ny iray amin'ireo famerimberenan'ny IFNα.Ao amin'ity kopia ity dia nahita tambajotram-pifandraisana azo itokisana maro ho an'ny HLA-A izahay.Ny famakafakana ny lalan'ny proteinina voatondron'ny MS/MS spectra dia nampiseho fa ny fanodinana sy ny fanolorana antigène mifototra amin'ny MHC-I no lalana lehibe ateraky ny interferon (sary 3D).Noho izany, nifantoka tamin'ny fandalinana ny fifandraisan'ny proteinina amin'ny molekiola MHC-I izahay miaraka amin'ny fahatokisana avo lenta amin'ny santionany mifamatotra.Ny HLA dia misy sehatra α1, α2 ary α3 ary rojo maivana, ary ny microglobulin β2 (β2m) dia proteinina chaperone tsy tapaka49.Rehefa tafangona ao amin'ny reticulum endoplasmic, ny HLA dia tsy miorina amin'ny tsy fisian'ny ligy peptide50.Ny groove peptide-binding dia noforonin'ny sehatra α1 sy α2 tena polymorphic sy tsy misy rafitra amin'ny endrika tsy peptide ary ny sehatra α351 polymorphic tsy dia misy loatra.Teo anatrehan'ny IFNα, dia nahita complexes HLA-A roa izahay: ny iray dia mifandray amin'ny HMGA1 sy H2B (sary 5, Table S3) ary ny iray hafa mifandray amin'ny MDN1, LRCH4 ary H2B (sary 6).
Ny IFNα dia miteraka tambajotram-pifandraisana HLA-A miaraka amin'ny H2B (H2BFS) sy HMGA1.(A) Tetika 2D (voaforona amin'ny rindrambaiko SIM-XL) mampiseho karazana fifandraisana samihafa ao amin'ny complex H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (manga), interlink (mena) ary rohy tokana (mainty)..Ny sehatra misy ny maha-samihafa azy dia misy kaody loko32: H2B (histone; 2–102) sy MHC-I (MHC_1; 25–203, vondrona C1; 210–290 ary MHC_I_C; 337–364).Ny fetran'ny cross-link dia napetraka amin'ny 3.5.Ny teboka dot dia manondro ny tranokalan'ny fifandraisana HLA-A miaraka amin'ny H2B (B) sy HMGA1 (C), ary koa ny tranokalan'ny fifandraisana K na S eo amin'ireo peptides roa.Ao amin'ny sary, ny tokonam-baravarana cross-link dia napetraka ho 3.0.(D) Fifandraisana eo amin'ny proteinina aseho amin'ny firafitry ny proteinina H2B, HLA-A, ary HMGA1 ao amin'ny programa PyMOL.Ireo rafitra ireo dia novolavolaina tamin'ny fampiasana ny mpizara Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ary ny firafitry ny template ho an'ny proteinina H2B, HLA-A ary HMGA1 dia 1kx552, 1kj349 ary 2eze55.
IFNα dia miteraka tambajotram-pifandraisana HLA-A miaraka amin'ny H2B (H2BFS), MDN1 ary LRCH4.(A) Rohy mifamatotra amin'ny intramolecular (mena) sy intermolecular (manga) aseho amin'ny sarintany interactive 2D (voaforona amin'ny rindrambaiko SIM-XL) miaraka amin'ny MDN1 aseho ho faribolana.Ny fetran'ny cross-link dia napetraka amin'ny 3.5.Ny sehatra misy identité samihafa dia misy loko code32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, vondrona C1; 210–290 ary MHC_I_C; 337–364) ary LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) sy CH (535–641)).(B) Fifandraisana eo amin'ny proteinina aseho amin'ny firafitry ny proteinina H2B, HLA-A, LRCH4, ary MDN1 ao amin'ny programa PyMOL.Ireo rafitra ireo dia novolavolaina tamin'ny fampiasana ny mpizara Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) miaraka amin'ny firafitry ny template 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ary 6i2665 ho an'ny proteinina H2B, HLA-A, LRCH4 ary MDN1, tsirairay avy.Tetika teboka mampiseho tranokalam-pifandraisana K na S ho an'ny HLA-A miaraka amin'ny H2B (C), LRCH4 (D), ary MDN1 (E).Ho an'ny teti-dratsy dia napetraka ho 3.0 ny fetran'ny salan'isa mifamatotra.
Ho fanampin'ny fitazonana ny fahamendrehan'ny genome, ny histone H2B dia tafiditra amin'ny fifehezana ny transcription.Ny proteinina H2B dia ahitana sehatra histone afovoany (HFD) voaforona amin'ny α-helices telo misaraka amin'ny tadivavarana ary ny rambony C-terminal 41,52.Ny ankamaroan'ny fifandraisana amin'ny H2B dia mitranga ao amin'ny helix α1, izay manome trimerization amin'ny heterodimer HFD (sary 5A, B).Na dia tafiditra amin'ny fatoran'ny ADN aza ny lysins, ny lysins sasany dia toerana acetylation na methylation hafa.Ohatra, ny sisa K43, K46, ary K57 avy amin'ny H2B dia tsy tafiditra amin'ny fatorana ADN mivantana, fa lasibatra amin'ny fanovana post-transcriptional isan-karazany53.Toy izany koa, ny sisa K44, K47, ary K57 ao amin'ny H2B dia mety manana anjara toerana hafa amin'ny fisian'ny IFNα, anisan'izany ny fifandraisana amin'ny proteinina hafa (sary 5A, B).Ho fanampin'izany, ny histon'ny extrachromosomal H2B dia manetsika ny valin'ny hery fiarovana amin'ny karazana sela isan-karazany, miasa ho toy ny sensor cytosolic mba hamantarana ireo sombintsombin'ny ADN (dsDNA) mitongilana roa avy amin'ny otrikaretina na sela simba54.Raha eo anatrehan'ny viriosy ADN, ny fihenan'ny H2B dia nanakana ny famokarana IFN-β sy ny phosphorylation STAT154.H2B dia fantatra ihany koa fa miditra sy mivoaka ny nucleus haingana kokoa noho ny histones fototra hafa54.Ny fifandraisana H2B amin'ny MDN1 sy LRCH4 dia voamarika ihany koa amin'ny santionany tsy voatsabo.Hitanay fa ny HLA-A dia nifandray tamin'ny H2B tamin'ny santionany telo voatsabo IFNα ary tamin'ny santionany miverimberina tsy voatsabo.Ireo angon-drakitra ireo dia maneho ny anjara asan'ny H2B amin'ny fiasa ara-batana hafa tsy miankina amin'ny fitsipika transcriptional.
Ny HMGA1 (vondrona avo lenta AT-Hook 1), nucleoprotein kely manankarena amin'ny asidra amine mampiroborobo ny aretina, dia fantatra fa mifandray amin'ny HLA-A.Manana rambony C-terminal asidra izy ary DBD telo miavaka antsoina hoe AT hooks satria mifatotra amin'ny lavaka kely amin'ny faritra manankarena AT ao amin'ny dsDNA55,56.Io famatorana io dia mahatonga ny ADN hiondrika na hanitsy, ahafahan'ny transcription kanônika miditra amin'ny filaharana marimaritra iraisana.Ny rambony C-terminal dia heverina fa tafiditra amin'ny fifandraisan'ny proteinina-proteinina sy ny fandraisana ireo anton-javatra transcription, satria tsy afaka manomboka ny transcription57 ny mutants deletion C-terminal.Ankoatra izany, ity sehatra ity dia misy tranokala phosphorylation maromaro voatahiry izay substrate fantatra amin'ny kinase 58.Hitanay ny fifandraisan'ny HLA-A sy H2B miaraka amin'ny HMGA1 ivelan'ny sehatra C-terminal, izay milaza fa ny sehatra C-terminal dia ampiasaina indrindra amin'ny fatorana transcription factor (sary 5A, C).Ny proteinina HMGA dia mifaninana amin'ny histone H1 amin'ny fifamatorana amin'ny ADN adaptatera, ka mampitombo ny fahafahana miditra57.Toy izany koa, toa azo inoana fa ny HMGA dia mifandray amin'ny histone H2B miaraka amin'ny ADN mampifandray amin'ny fifaninanana amin'ny histone H1.Ny HMGB1 dia mampirisika ny fanehoana ny HLA-A, -B, ary -C amin'ny sela dendritika, izay mitarika amin'ny fampahavitrihana azy59, fa ny fifandraisana misy eo amin'ny HMG sy HLA dia tsy mbola notaterina teo aloha.Hitanay fa ny HMGA1 dia mifandray amin'ny sehatra α1 sy α3 an'ny HLA-A, miaraka amin'ny ankamaroan'ny fifandraisana ivelan'ny 3 DBD (sary 5A, C).Eo am-pelatananay, ny HLA-A dia hita ao amin'ny nucleus (data tsy aseho), ary raha ny H2B sy HMGA1 dia misy ihany koa ao amin'ny nucleus, mety hitranga ao amin'ny nucleus io fifandraisana io.Aseho amin'ny sary 5D ny fanampim-panazavana voafaritra eo anelanelan'ny H2B, HLA-A, ary HMGA1.
Ny ankamaroan'ny fifandraisana amin'ny HLA-A amin'ny proteinina hafa dia mitranga ao anatin'ny sehatra α1 sy α2 ary ny sehatra C-terminal mikorontana (sary 6).Ao amin'ny iray amin'ireo ohatra ireo dia hitanay fa ny HLA-A dia mifandray amin'ny rambony N-terminal LRCH4 (sary 6A, D).Ny LRCH4 dia manara-maso ny fampahavitrihana TLR4 sy ny fampidirana cytokine LPS, ka manova ny valin-kafatra voajanahary voajanahary60,61.Izy io dia proteinina membrane misy leucine sivy miverimberina (LRRs) sy calmodulin (CH) homology motif ao amin'ny ectodomain, arahin'ny domaine transmembrane (TMD) 60, 62.Ny sehatra CH dia voalaza fa manelanelana ny fifandraisan'ny proteinina-proteinina 60.Asidra amino 300 eo ho eo eo anelanelan'ny sehatra LRR sy CH dia azo idirana nefa tsy misy dikany.Miorina amin'ny asan'ny faritra mikorontana amin'ny maha-mpanelanelana ny tambajotra proteinina-proteinina sy ny fitaterana vesicular 63, dia hitanay fa ny ankamaroan'ny fifandraisana amin'ny proteinina dia mitranga any amin'ny faritra mikorontana.Ny fifandraisana amin'ny MDN1 dia nozaraina manerana ny halavan'ny proteinina, anisan'izany ny LRR1, LRR6, CH domains, ary ny faritra kisendrasendra, raha ny H2B kosa dia mifamatotra amin'ny sehatra CH (sary 6A, B).Marihina fa tsy misy ny fifandraisana misy ny TMJ, manolotra ny maha-tokana ny fomba fiasa CLMS (sary 6A, B).
MDN1 dia fantatra ihany koa ho anisan'ny tambajotra proteinina HLA-A (sary 6A).An'ny fianakaviana proteinina AAA (ATPases mifandray amin'ny hetsika samihafa).Io no sehatra AAA N-terminal mitovy amin'izany izay mikambana ao anaty peratra hexameric ary manaisotra ny antonan'ny fivoriambe amin'ny subunit ribosomal 60S 64.toa mitovy amin'ny dynein64,65,66.Ankoatr'izay, ny faritra manankarena Asp/Glu dia arahin'ny sehatra MIDAS (toerana miankina amin'ny ion metaly).Noho ny haben'ny MDN1 (eo ho eo amin'ny 5600 asidra amine) sy ny homolojia voafetra miaraka amin'ny proteinina voadinika tsara, dia tsy dia fantatra loatra ny firafiny sy ny asany amin'ny olombelona.Nahafantatra ny HLA-A, H2B, ary LRCH4 ho mpiara-miombon'antoka MDN1 izahay ary nanambara ny fiorenan'izy ireo ho complexe proteinina ao amin'ny PyMol (sary 6A, B).Ireo proteinina telo ireo dia mifandray amin'ny sehatra AAA, ny sehatra mpampitohy toy ny dynein, ary angamba ny sehatra MIDAS MDN1.Tao amin'ny tatitra teo aloha, ny fanadiovana fifandraisana amin'ny proteinina bait dia namaritra ny MDN1 ho proteinina mifandray amin'ny histone H2B67.Ankoatr'izay, ny fanadihadiana vao haingana dia nitatitra ihany koa ny fifandraisana misy eo amin'ny MDN sy HLA-B ao amin'ny sela HCT116 amin'ny fampiasana spectrometry faobe voadio affinity, izay manohana ny fikarohana68.Ny famantarana an'io complexe io amin'ny santionany voatsabo IFNα dia manolotra anjara asa ho an'ny MDN1 amin'ny famantarana interferon.
Satria ny fototarazo HLA dia polymorphic be dia be, dia nalainay ny filaharana mamaky ny sari-tany HLA-A, -B, ary -C avy amin'ny angon-drakitra momba ny RNA amin'ny sela Flo-1 (tsy aseho ny data).Ny filaharan'ny peptide mifanaraka amin'ny famakiana filaharana dia mampiseho fahasamihafana lehibe eo amin'ny HLA-A, -B, ary -C any amin'ny faritra misy ny peptides mifamatotra amin'ny HLA-A (sary S3).Ankoatr'izay, tsy nahita ny fifamatorana proteinina amin'ny proteinina amin'ny molekiola HLA-B / C miaraka amin'ny proteinina H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4 izahay.Izany dia manondro fa ny fifandraisana proteinina hita eo amin'ny HLA-A, MDN1, LRCH1 ary HMGA1 dia HLA-A manokana.Ankoatr'izay, ny fanadihadiana proteomika momba ny santionany tsy mifamatotra (Table S4) dia naneho fa ny HLA-A dia manana fandrakofana filaharana ambony kokoa raha oharina amin'ny HLA-B na HLA-C.Ny peptides fantatra ho an'ny HLA-A dia avo lenta amin'ny santionany IFNα voatsabo sy tsy voatsabo.
Mba hahazoana antoka fa ny fifaneraserana fantatra eto dia tsy noho ny fifamatorana tsy voafaritra manokana amin'ny proteinina roa mifanakaiky amin'ny habakabaka, dia nanamafy ny anton-javatra roa mifandraika amin'ny HLA-A vaovao izahay amin'ny fanaovana fitiliana co-immunoprecipitation.Ny fifandraisan'ny HLA-A amin'ny MDN1 sy ny H2B endogenous dia hita ao amin'ny sela Flo-1 voatsabo sy tsy voatsabo (sary 7, sary S4).Nohamafisinay fa ny HLA-A dia nosamborin'ny H2B tao amin'ny immunoprecipitates ary io fikambanana io dia noho ny fitsaboana IFNα satria ny HLA-A dia tsy teo amin'ny santionany immunoprecipitate avy amin'ny sela tsy voatsabo (sary 7A).Na izany aza, ny angon-drakitray dia manoro hevitra fa ny IFNα dia mifehy ny HLA-A mifamatotra amin'ny H2B sy MDN1.Ny IFNα dia mampirisika ny fifandraisana eo amin'ny H2B sy HLA-A, saingy mampihena ny fifandraisany amin'ny MDN1.Hitanay fa ny MDN1 dia mifandray amin'ny HLA-A amin'ny fanaraha-maso, ary ny fanampiana ny IFNα dia nampihena io fifandraisana tsy miankina amin'ny fampidirana MDN1 an'ny IFNα (sary 7B, C).Ankoatr'izay, ny immunoprecipitation HLA-A dia naka ny H2B tao amin'ny sela A549 (sary S4), izay manoro hevitra fa tsy miankina amin'ny karazana sela io fifandraisana io.Raha atambatra, ireo valiny ireo dia manohana ny fifandraisana interferon-mediated amin'ny HLA-A miaraka amin'ny H2B sy MDN1.
HLA-A dia manadio H2B sy MDN1.Ny immunoblots endogenous H2B (A) sy MDN1 (B) solontenan'ny immunoprecipitated avy amin'ny sela Flo-1 voatsabo IFNα ary nanadihady ireo antibody voalaza.Ny totozy sy ny bitro IgG dia nampiasaina ho fanaraha-maso ratsy.(C) Ny habetsan'ny antigène samihafa dia aseho amin'ny alàlan'ny immunoblots voasokajy amin'ny antibody voalaza, ny β-actin dia nampiasaina ho fanaraha-maso entana.
Ny fananana ara-drafitra amin'ny iray amin'ireo tambajotra mifandray amin'ny interferon azo antoka indrindra, H2B-HLA-A-HMGA1, dia nohadihadiana.Nampiasa ny modelin'ny dinamika molekiola izahay ho fomba iray hafa mba hahatakarana ny dinamika mifanaraka amin'ny proteinina tafiditra ao anatin'ity sarotra ity (sary 8).Ny fanatsoahan-kevitra avy amin'ny angon-drakitra CLMS dia manolotra ny mety hisian'ny fampifanarahana samihafa amin'ny proteinina H2B, HLA-A, ary HMGA1.Noho izany, ireto complexes mety manaraka ireto dia novolavolaina tamin'ny fitaovana solvent: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ary H2B-HLA-A-HMGA1.Ny efijery voalohany amin'ny proteinina-proteinina amin'ny fampiasana ny MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Quebec, Canada) dia nanolo-kevitra ny mety hisian'ny conformations izay tsy mitovy amin'ireo proteinina ireo (sary 8A).Ny fijerena ny complexe proteinina docking dia nanambara fifandraisana maro sy mety ho conformations (sary 5A, 8).Noho izany, ny conformation iray azo atao dia aseho ao amin'ny Figure 8A (miaraka amin'ny rohy misy marika) ary nodinihina bebe kokoa izany tamin'ny alàlan'ny fantsona modely MD.Ankoatra izany, ny famatorana ny H2B na HMGA1 amin'ny HLA-A dia manasongadina ny fifandraisana ambony kokoa amin'ny H2B ho an'ny HLA-A (sary 8A).
Ny dinamika mifanaraka amin'ny tambajotra azo atao eo anelanelan'ny komplex H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A ary H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Ny tontonana havia dia sarintany 2D (voaforona amin'ny rindrambaiko SIM-XL) misy rojom-pifandraisana intramolecular (mena) sy intermolecular (manga) (tapahan'ny crosslink napetraka amin'ny 3.5).Ankoatr'izay, ny sisa tavela mifandray amin'ny fifandraisana fantatra dia misy marika amin'ny firafitry ny proteinina H2B, HLA-A, ary HMGA1.Ny fampifanarahana mifandraika amin'ireo proteinina ireo dia nalaina tamin'ny alàlan'ny fantsona docking napetraka tao amin'ny fonosana MOE.Ny tontonana ambany havia dia mampiseho ny fampifanarahana isan-karazany amin'ny komples H2B-HLA-A sy HMGA1-HLA-A miaraka amin'ny fifandraisana misy proteinina-proteinina samihafa (GBVI / WSA dG; kcal / mol).(B) Fivavahana mahazatra (RMSD) amin'ny toerana atomika (ankoatra ny atôma hidrôzenina) ho an'ny rafitra proteinina tsirairay.(C) Intermolecular protein-protein'ny hydrogène fifamatorana avy amin'ny simulated complexes isan-karazany mihevitra ny fifandraisana manokana ny faharetan'ny ≥ 10 ns.Ny halaviran'ny 3.5 Å, ny halaviran'ny mpanome h-acceptor h-fatorana dia napetraka amin'ny ≥ 160 °-180 °.(D) Ny sisa tavela amin'ny firafitry ny HLA-A proteinina-proteinina mifandray amin'ny mpiara-miombon'antoka tsirairay avy, mirefy ≥ 20 ns, nalaina avy amin'ny complexes HLA-A-H2B sy HLA-A-HMGA1.Ny firafitry ny proteinina dia maneho rafitra antonony amin'ny 100 ns MDS.(E) Fifandraisana eo amin'ny HLA-A-H2B sy HLA-A-HMGA1 complexes raha ampitahaina amin'ny fifaneraserana arahin'ny simulation H2B-HLA mihoatra ny 100 ns mifototra amin'ny tranokalan'ny fifandraisana K na S eo amin'ireo peptides roa.Complexes /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Ny sandan'ny tokonam-baravarana ho an'ny fanombanana ny fifamatorana dia napetraka amin'ny 3.0, ary ny fifandraisana manokana avy amin'ny MDS maka ≥ 10 ns dia noraisina.Ny firafitry ny proteinina dia nojerena tamin'ny alàlan'ny BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, Etazonia) sy ny Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Quebec, Canada).
Ny fahamarinan-toeran'ny molekiola HLA-A amin'ny fotoana (fivavahana manara-penitra; RMSD na fiovaovan'ny fenitra; RMSF) dia nanondro fa ny fisian'ny proteinina H2B na HMGA1 ao amin'ny complexes dia nanamafy ny HLA-A (sary 8B, sary S5).Ny proteinina HMGA1 dia mifamatotra mafy amin'ny tranokala B2M an'ny HLA-A, mampirisika ny fahamarinan'ny asidra amine HLA-A ao amin'ny complex HLA-A-HMGA1 na H2B-HLA-A-HMGA1 (sary 8B, sary S5).indrindra indrindra, ny sisa tavela amin'ny HLA ~ 60-90 sy ~ 180-210 dia hita fa tsy dia mihetsiketsika loatra amin'ny fisian'ny H2B (sary 8B).Ny H2B sy HMGA1 dia nampiseho famatorana tsara kokoa amin'ny HLA-A ao amin'ny komplex H2B-HLA-A-HMGA1 raha oharina amin'ny HLA-A mifatotra amin'ny H2B na HMGA1 irery (sary 8C, D; Table S5).Ny sisa tavela amin'ny fatoran'ny hydrogène (MD modely avo lenta ≥ 10 ns) dia mifanandrify amin'ny tranokalan'ny fifandraisana CLMS (K na S sisa) ao amin'ny complex, izay milaza fa ny fifandraisana voamariky ny CLMS dia tena azo itokisana.Azo itokisana (sary 8E).Ao amin'ny modely CLMS sy MD, ny sisa tavela HLA-A eo anelanelan'ny 190-210 sy 200-220 eo ho eo amin'ny asidra amine dia hita fa mamatotra H2B sy HMGA1 (sary 8E).
Ny fifandraisan'ny proteinina-proteinina dia mamorona tambajotra ara-drafitra mavitrika izay manelanelana ny fifandraisana anaty sela ho setrin'ny fanentanana sasany.Satria maro amin'ireo fomba fiasa proteomika no mahita ny fiovana amin'ny haavon'ny proteinina iray manontolo, ny dinamika mifandray amin'ny proteinina-proteinina dia mitaky fitaovana fanampiny hisintonana ny fifandraisana mifamatotra, ary ny CLMS dia fitaovana iray toy izany.Ny rafitra famantarana interferon dia tambajotra cytokine izay ahafahan'ny sela mamaly amin'ny karazana famantarana pathological pathogenic sy intrinsic amin'ny tontolo iainana, izay miafara amin'ny fampidirana ny ampahany amin'ny proteinina interferon-inducible.Nampiasa CLMS izahay mba hamaritana raha azo fantarina ny fifaneraserana proteinina-proteinina vaovao eo amin'ny tontolon'ny proteinina interferon.Ny famakafakana fifandraisana mifamatotra amin'ny proteinina manerantany amin'ny modelin'ny sela Flo-1 izay mamaly interferon dia nampiasaina mba hisambotra ireo complexes proteinina.Ny fitrandrahana ny peptides tryptic avy amin'ny sela tsy mifamatotra sy mifamatotra dia mamela ny fanisana peptide, ny fanatsarana ny lalana ary ny fizarana halavan'ny peptide miaraka amin'ny hamafin'ny LFQ voafaritra.Ny proteinina interferon-inducible canonical dia fantatra ho fanaraha-maso anatiny tsara, raha toa kosa ny fampidirana intermolecular sy intramolecular cross-linked interferon-inducible canonical toy ny MX1, UP18, OAS3 ary STAT1.Nohadihadiana ireo endri-drafitra isan-karazany sy ny fifandraisana amin'ny faritra miasa.
Ny fifandraisana misy eo amin'ny HLA-A, MDN1 ary H2B dia hita tamin'ny alàlan'ny immunoblotting ao amin'ny sela Flo-1 sy A549 voatsabo sy tsy voatsabo amin'ny IFNα.Ny valiny dia manasongadina fa ny HLA-A complexes miaraka amin'ny H2B amin'ny fomba miankina amin'ny IFNα.Ny asantsika dia maneho fomba mahaliana ho an'ny fikarohana bebe kokoa momba ny fiaraha-miombon'antoka amin'ireo complexes roa ireo.Mahaliana ihany koa ny manitatra ny fomba fiasa CLMS amin'ny tontolon'ny tsipika sela mba hamantarana ny fifandraisana proteinina interferon tsy miankina amin'ny sela.Farany, nampiasa ny modeling MD izahay ho fomba iray hafa hahafantarana ny dinamika conformational amin'ny proteinina tafiditra ao amin'ny complex H2BFS-HLA-A-HMGA1, izay nanara-maso ny fifanakalozan-dresaka intramolecular sy intermolecular.Ny fanatsoahan-kevitra avy amin'ny angon-drakitra CLMS dia manolotra ny mety hisian'ny fampifanarahana samihafa amin'ny proteinina H2BFS, HLA-A, ary HMGA1.Ny fampifanarahana mety ho samy hafa eo amin'ireo komples proteinina docking ireo dia nanambara fifandraisana maro mitovy amin'ireo hita ao amin'ny angona CLMS.Ny iray amin'ireo tanjaka lehibe amin'ny fombantsika dia ny mamela ny famantarana mora amin'ny fifandraisana amin'ny fototarazo polymorphika be toy ny HLA, noho izany dia mahaliana ny mianatra ny fifandraisana amin'ny proteinina HLA haplotype manokana izay sarotra ny mianatra.Raha atambatra, ny angon-drakitray dia mampiseho fa ny CLMS dia azo ampiasaina hanitarana ny fahatakarantsika ny tambajotra famantarana interferon-induced ary manome fototra ho an'ny fandalinana ny rafitra intercellular sarotra kokoa ao amin'ny microenvironment tumor.
Ny cellules Flo-1 dia azo avy amin'ny ATCC ary notazonina tao amin'ny DMEM (Gibco) nampiana 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen), 10% foetal bovine serum (Gibco) ary voatahiry ao amin'ny 37 ° C sy 5% CO2.Incubation.Ny sela dia nitombo ho 70-80% confluence alohan'ny fitsaboana amin'ny IFNα14 (novokarin'ny Edinburgh Protein Production Facility).Ny zavatra simika sy reagents hafa rehetra dia novidina tamin'ny Sigma Aldrich raha tsy misy fanamarihana manokana.
Ny sela Flo-1 dia nokolokoloina tamin'ny takelaka 6-well ary ny ampitson'iny dia notsaboina tamin'ny 10 ng / ml IFNα14 ny sela mandritra ny 24 ora ka hatramin'ny 80% eo ho eo.Ny sela dia nosasana in-telo tamin'ny PBS ary nofatorana tamin'ny DSS (Thermo Fisher Scientific) vao voaomana (levo ao amin'ny DMSO) ao amin'ny PBS mandritra ny 5 min amin'ny 37 ° C. amin'ny fifantohana farany amin'ny 0.5 mM.Ny fanehoan-kevitry ny fifandraisana DSS dia nosoloina PBS ary ny DSS sisa dia nesorina tamin'ny fampidirana 20 mM Tris (pH 8.0) ao amin'ny PBS mandritra ny 15 min amin'ny 37 ° C.Ny sela dia nangonina tamin'ny alalan'ny fikikisana ary nangonina tao anaty fantsona mifatotra ambany (Axygen).
Ny pellet sela dia nopotehina tamin'ny 300 µl buffer urea lysis (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) nandritra ny 30 min tamin'ny mari-pana amin'ny efitrano miaraka amin'ny fihovitrovitra indraindray.Ny dingana centrifugation rehetra dia natao tamin'ny 14,000 xg amin'ny 8 ° C.Atsofohy mandritra ny 10 minitra ny lysate ary afindrao amin'ny fantsona vaovao ny supernatant.Ny poti-javatra mazava sisa tavela dia levona ao amin'ny 150 μl ny buffer lysis faharoa (2 M urea, 2% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) mandritra ny 30 minitra na mihoatra mandra-pahazoan'ny vahaolana aqueous homogeneous.Ny lysate dia natao centrifuge nandritra ny 20 minitra ary ny supernatant dia nafangaro tamin'ny lysate azo tamin'ny dingana teo aloha.Ny fatran'ny proteinina dia nodinihina tamin'ny fampiasana ny Micro BCA assay (Thermo Fisher Scientific) araka ny torolalan'ny mpanamboatra momba ny fomba fiasa microplate.Ny santionany dia nafaingana haingana tamin'ny azota ranoka ary voatahiry amin'ny -80 ° C.
Manodidina ny 100 μg ny proteinina mifamatotra amin'ny soluble dia nokarakaraina tamin'ny alàlan'ny protocol filtration sample preparation (FASP) novaina araka ny nofaritan'i Wisniewski et al.69 Fohy, ny proteinina dia mifamatotra amin'ny 200 µl ny urea buffer (8 M urea amin'ny 0,1 M Tris, pH 8,5), vortexed sy ny antsasaky.Ny dingana centrifugation rehetra dia natao tamin'ny 14,000 xg amin'ny 25 ° C.Ny tapany voalohany amin'ny lysate proteinina mifamatotra dia nafindra tao amin'ny fitaovana sivana centrifugal 10 kDa Microcon izay misy membrane Ultracel-10 (Merck), arahin'ny centrifugation amin'ny sivana mandritra ny 25 minitra.Avy eo ampio ny tapany faharoa amin'ny proteinina amin'ny sivana ary avereno ny dingana mitovy.Ny fanarenana ny proteinina dia natao tamin'ny fampidirana 100 μl amin'ny 17 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) amin'ny buffer urea.Ny fanarenana dia nesorina tamin'ny thermomixer amin'ny 600 rpm mandritra ny 30 minitra amin'ny 37 ° C.Ankoatra izany, ny tsanganana dia centrifuged ary ny proteinina nihena cross-linked dia alkylated mampiasa 100 μl ny 50 mM iodoacetamide amin'ny urea buffer.Ny fanehoan-kevitra alkylation dia natao tamin'ny mari-pana mandritra ny 20 minitra ao anaty haizina.Ahodiho ny tsanganana, sasao in-3 ny rindrin'ny tsanganana amin'ny buffer urea 100 µl, ary avy eo centrifuge.Toy izany koa no natao in-3 tamin'ny fampiasana 100 μl of 100 mM ammonium bikarbonate.Alohan'ny trypsinization, manolo ny fantsona fanangonana vaovao.Ampio buffer fandevonan-kanina misy 50 mM ammonium bikarbonate sy 1 µl trypsin voatoto ao anaty buffer trypsin (Promega).Notazonina teo amin’ny 1:33 eo ho eo ny tahan’ny trypsin amin’ny proteinina, ary natsofoka nandritra ny alina tamin’ny 37° C. tao amin’ny efitra mando ny fihetsiky ny fandevonan-kanina.Ny peptide crosslinked dia nesorina tamin'ny sivana tamin'ny centrifugation nandritra ny 25 minitra.Ny fanarenana ny peptide dia nohatsaraina tamin'ny fampidirana 50 μl 0,5 M NaCl amin'ny sivana, arahin'ny centrifugation mandritra ny 25 minitra.
C18 Micro Spin columns (Harvard Apparatus) dia nampiasaina mba hanesorana ny peptides tryptic mifandray amin'ny cross-linked manaraka ny protocole nofaritan'i Bouchal et al.70 miaraka amin'ny fanovana kely.Raha fohifohy, ny tsanganana spin C18 dia navitrika tamin'ny fanasana telo amin'ny 0.1% formic acid (FA) amin'ny acetonitrile (AcN) (Merck) ary fanasana roa amin'ny 0.1% FA.Ny tsanganana dia nodiovina tamin'ny 0,1% FA nandritra ny 15 minitra.Ampidiro ao amin'ny tsanganana mihodina ny santionany ary sasao in-3 amin'ny FA 0,1%.Ny peptides desalted dia nalaina tamin'ny gradient stepwise tamin'ny fampiasana 50%, 80% ary 100% AcN amin'ny 0.1% FA.Ny santionany dia maina tao amin'ny SpeedVac Plus concentrator (Eppendorf) mandra-panjavona tanteraka ny ranon-javatra sisa.Ny peptides eluted dia levona amin'ny 100 μl amin'ny asidra trifluoroacetic 0.08% amin'ny 2.5% AcN ary ny fifantohana dia norefesina tamin'ny NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Manodidina ny 1 μg ny peptide mifamatotra isaky ny santionany no nampidirina tao amin'ny rafitra LC-MS / MS.
Ny peptides mifamatotra mifamatotra dia nisaraka tamin'ny rafitra UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) mifandray amin'ny spectrometer faobe Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Ny peptides mifandray amin'ny cross-linked dia nangonina tamin'ny ID 300 µm, tsanganana fisamborana µ-pre-column C18 5 mm lava tsanganana feno C18 PepMap100 sorbent ary 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Atsofohy amin'ny 5 µl/min 0,08% ny asidra trifluoroacetika levona ao anaty 2,5% AcN ny fikorianan'ny paompy.Ny peptides mifamatotra amin'ny hazondamosina dia nosarahina tamin'ny tsanganana silika analytika misy savaivony anatiny 75 μm ary 150 mm ny halavany, feno sorbent 2 μm PepMap (Thermo Scientific).Ny dingana finday A sy B dia misy 0.1% FA amin'ny rano ary 0.1% FA amin'ny acetonitrile.Ny gradient dia manomboka amin'ny 2.5% B ary mitombo tsikelikely mankany amin'ny 40% B mandritra ny 90 minitra, avy eo amin'ny 90% B mandritra ny 2 minitra manaraka.Notazonina tamin'ny 90% B nandritra ny 10 minitra ny firafitry ny dingana finday ary nihena tsikelikely ho 2.5% B nandritra ny 2 minitra.Ny tsanganana dia nampitoviana tamin'ny 2,5% B nandritra ny 8 minitra alohan'ny fihodinana manaraka.Ny peptides mifamatotra amin'ny hazondamosina nalaina avy amin'ny tsanganana famakafakana dia nodiovina tao amin'ny loharano nanoelectrospray ionization (NSI) ary natsindrona tao amin'ny Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).
Ny Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer dia miasa amin'ny fomba fampifandraisana data tsara.Ny scan feno dia natao tamin'ny fomba fizarana tamin'ny famahana ny 120,000 miaraka amin'ny fikandrana isan-karazany manomboka amin'ny m/z 350 Th ka hatramin'ny m/z 2000 Th.Ny lasibatra AGC mahazatra dia napetraka amin'ny 300% miaraka amin'ny fotoana fampidirana ambony indrindra 50ms.Ny fitiliana tampon'ny monoisotopic dia napetraka ho an'ny peptides.Ny mari-pamantarana fanalefahana teritery dia apetraka ho marina raha toa ka vitsy ny mpialoha lalana hita.Ny tanjaky ny iônika kely indrindra amin'ny precursor dia napetraka ho 5.0e3 ary ny fiampangana mialoha ny +8 dia nampidirina tao amin'ny fanandramana.
Ny vanim-potoanan'ny tsingerina eo anelanelan'ny scan lehibe amin'ny fomba fampifandraisana angon-drakitra dia napetraka ho 2.5 segondra.Ny fanilihana faobe dynamika dia napetraka ho 20 s taorian'ny fizarazarana voalohany ny ion mialoha.Ny varavarankelin'ny fitokana-monina mialoha dia napetraka ho 2 Th.Ny karazana angovo fifandonana ara-dalàna miaraka amin'ny fomba angovo fifandonana raikitra dia nofidina tamin'ny scan MS/MS miankina amin'ny angona.Ny angovo fifandonana napetraka ho 30%.Ny famahana ny Orbitrap dia napetraka ho 15,000 ary ny tanjona AGC ho 100%.Ny fotoana fanindroany ambony indrindra dia apetraka amin'ny 60 milisegondra.
Alohan'ny hanaraha-maso ny tambajotra proteinina-proteinina amin'ny santionany mifamatotra, dia nokarakarainay ny rakitra manta amin'ny alàlan'ny fonosana MaxQuant (version 1.6.12.0)26,27 mba hamantarana ny peptides / proteinina azo trace ao amin'ny santionany.Fanampin'izany, ny famakafakana proteomika mitovy amin'izany dia natao tamin'ny santionany Flo-1 tsy misy ifandraisany ary tsy voatsabo amin'ny IFNα.Ny angon-drakitra MS/MS dia nokarohina tao amin'ny angona olombelona UniProt (www.uniprot.org) (nampiakarina tamin'ny 12 aogositra 2020, misy fidirana 75,093) amin'ny fampiasana ny motera fikarohana Andromeda27.Ny fikarohana dia natao tsy nanondro ny maha manokana ny anzima sy ny fanovana isan-karazany ny deamidation (N, Q) sy ny oxidation (M).Ny fandeferana faobe mialoha dia napetraka amin'ny 20 ppm ary ny vokatra ion amin'ny 0.02 Da.Ny fiviliana voalohany sy ambony indrindra dia napetraka ho 10 ppm.Ny faobe ambony indrindra amin'ny peptide dia napetraka amin'ny 4600 Da ary ny fitovian'ny filaharana dia napetraka eo anelanelan'ny 7 sy 25 asidra amine (aa).Ny famakafakana statistika fanampiny dia natao tamin'ny fampiasana ny programa Perseus (dikan-teny 1.6.10.45).Ny votoatin'ny proteinina dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny fanamafisana ny hamafin'ny proteinina (fahaizana LFQ; fatra tsy misy marika)27 ary navadika ho Log2 ny sandan'ny hamafiny.Ny fivondronamben'ny proteinina fantatra amin'ny hamafin'ny peptide azy dia natsangana tamin'ny alàlan'ny fonosana pheatmap (v1.0.12) ao amin'ny R (v 4.1.2).Ny famakafakana fampitomboana ny lalana dia natao tamin'ny fampiasana ny tahiry Reactome pathway ho an'ny proteinina voatsabo IFNα izay mihoatra ny in-efatra navitrika raha oharina amin'ireo santionany tsy voatsabo.
Famantarana ny lysine (K) na serine (S) simika manokana crosslinks proteinina complexes manara-maso ny LC-MS / MS dia natao tamin'ny alalan'ny spectroscopic famantarana milina (SIM-XL) ho an'ny cross-linked peptides (SIM-XL)29.Voalohany, ny fifandraisana mety misy eo amin'ny interferon-associated (IFN) DNA damage resistance signature (IRDS) dia nodinihina tamin'ny fampiasana ny IRDS protein dataset voalaza ao amin'ny Padariya et al.28.Ny fijerena ny toe-javatra rehetra sy ny famerimberenan'ny UniProt olombelona manontolo dia mavesa-danja amin'ny fikajiana, ka ny angon-drakitra UniProt olombelona manontolo (www.uniprot.org) (nalaina tamin'ny 12 Aogositra 2020, dia misy fidirana 75,093) manohitra ny fiverenan'ny IFNα.Iray amin'ireo sivana ho an'ny fifampitokisana ambony.Nitarina sy nosedraina tamin'ny famerimberenana sy ny fepetra rehetra ireo fifaneraserana manan-danja azo ireo.
Ao amin'ny SIM-XL, DSS dia nampiasaina ho an'ny crosslinker (XL) ary ny fiovan'ny lanjan'ny XL sy ny fiovan'ny lanja fanovana dia napetraka ho 138.06 sy 156.07, tsirairay avy.Ireto toerana misy fanehoan-kevitra mifamatotra ireto dia raisina: KK, KS ary KN-TERM, tsy misy ion mpanao gazety.Samy napetraka ho 20 ny ppm mialoha sy ny sombiny ary ny tokonam-baravarana Xrea dia napetraka ho 0.15.Ny Trypsin dia noheverina ho voafaritra tanteraka, ary nampiharina ny fomba fanaparitahana C-trap (HCD) mahery vaika.Ny tokonam-baravaran'ny fampihenana DB dinamika XCorr sy ny isan'ny peptides kely indrindra ho an'ny fihenan'ny DB mavitrika dia napetraka ho 2.5 sy 2.Ny mari-pamantarana hafa dia: ny mety ho monoisotope sy ny fahatapahan'ny kisendrasendra ambony indrindra, ny sisa tavela 4 AA isaky ny tady sy ny fiampangana kofehy ambony indrindra, ary ny 3 maxima amin'ny fisarahana tsy hita.Ny sarintany 2D voazaitra dia nodinihina tao amin'ny (SIM-XL) ary ny fanehoana an-tsary xQuest28 dia nampiasaina hanamboarana ny sarintany 2D.Ny fifamatorana proteinina amin'ny rafitra proteinina dia omena ao amin'ny PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC).
Ny rafitra modelin'ny proteinina dia noforonina tamin'ny fampiasana ny mpizara Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 amin'ny fampiasana ny fitsipiky ny modely homolojia sy ny fampiharana ny "Metode Markov miafina".Ny Phyre2 dia mamorona rafitra modely mifototra amin'ny fampifanarahana ny filaharana miaraka amin'ireo rafitra proteinina fantatra.Ho an'ny proteinina H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, ary MDN1, dia nampiasaina ny rafitra template 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, ary 6i2665.Ankoatra izany, ny firafitry ny AlphaFold71 MX1, UBP18 ary ROBO1 dia nodinihina ihany koa.Ny firafitry ny proteinina dia naseho tamin'ny alàlan'ny fonosana BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, Etazonia) sy ny fonosana Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Quebec, Canada).