347 12.7 * 1.24mm Stainless vy coiled Tubing, Molecular rafitra ny synchronous electrostatic condensation sy coaggregation ny α-synuclein sy tau

Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Mampiasa kinova mpitety tranonkala manana fanohanana CSS voafetra ianao.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Ho fanampin'izany, mba hiantohana ny fanohanana mitohy, dia asehoy ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript.
Sliders mampiseho lahatsoratra telo isaky ny slide.Ampiasao ny bokotra aoriana sy manaraka mba hivezivezena amin'ny slides, na ny bokotra mpanara-maso ny slides amin'ny farany mba hivezivezena amin'ny slide tsirairay.

347 Stainless Steel Sodina Famaritana

347 12.7 * 1.24mm Stainless vy coiled tubing

Savaivony ivelany: 6.00 mm OD hatramin'ny 914.4 mm OD, Habe hatramin'ny 24" NB misy Ex-stock, OD Size Steel Tubes misy Ex-stock

SS 347 Haben'ny fantsona: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, sns.

Karazana: SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW Pipes |SS 347 Welded Pipes |SS 347 Fabricated Pipes |SS 347 CDW Tube, LSAW Pipes / Seam-welded / Reddrawn

Endriny: SS 347 Round Pipes/Tubes, SS 347 Square Pipes/Tubes, SS 347 Rectangular Pipe/Tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 “U” Shape, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

Halavany: Kisendrasendra tokana, Kisendrasendra indroa & Faran'ny halavany ilaina: Faran'ny tsotra, fiafarana miolikolika, voahitsakitsaka

Fiarovana farany: Satroka plastika |Outside Finish: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Finish ho an'ny Stainless Steel Pipes, Vita araka ny fepetra takian'ny mpanjifa

Toetran'ny fanaterana: Nopotehina sy nopotehina, voaporitra, nasiana mamiratra, voasintona mangatsiaka

Fanaraha-maso, Tatitry ny fitsapana: Taratasy fitsapana Mill, EN 10204 3.1, Tatitry ny simika, Tatitry ny mekanika, Tatitry ny fitsapana PMI, Tatitry ny fisafoana hita maso, Tatitry ny fisafoana avy amin'ny antoko fahatelo, Tatitry ny laboratoara nankatoavin'ny NABL, Tatitra fitsapana manimba, Tatitra fitsapana tsy manimba

Fonosana: Fonosana ao anaty boaty hazo, harona plastika, tsipika vy mitambatra, na araka ny fangatahan'ny mpanjifa

Specials: Ny habe sy ny fepetra hafa ankoatra ny etsy ambony dia azo amboarina amin'ny fangatahana

SS 347 Haben'ny fantsona: 1/2 santimetatra NB, OD hatramin'ny 24 santimetatra

ASTM A312 347: Sodina austenitic welded tsy misy seam sy mahitsy natao ho an'ny serivisy amin'ny hafanana ambony sy amin'ny ankapobeny.Tsy azo atao ny famenoana metaly mandritra ny lasantsy.

ASTM A358 347: Fampifangaroana elektrika welded austenitic pipe ho an'ny serivisy manimba sy / na hafanana avo.Amin'ny ankapobeny dia fantsona hatramin'ny 8 inch ihany no vokarina amin'ity famaritana ity.Ny fampidirana metaly filler dia avela mandritra ny lasantsy.

ASTM A790 347: Fantsona feritika/austenitic (duplex) tsy misy seam sy mahitsy natao ho an'ny serivisy manimba amin'ny ankapobeny, miaraka amin'ny fanamafisana manokana amin'ny fanoherana ny fikorontanan'ny adin-tsaina.

ASTM A409 347: Fampifangaroana herinaratra mahitsy na spiral-seam vita amin'ny sodina lehibe austenitic jiro rindrina amin'ny habe 14 "hatramin'ny 30" misy rindrina Sch5S sy Sch 10S ho an'ny manimba sy/na avo.

ASTM A376 347: Sodina austenitic tsy misy seam ho an'ny fampiharana hafanana ambony.

ASTM A813 347: Sodina austenitika tokana, tokana na roa-welded ho an'ny mari-pana ambony sy ny fampiharana amin'ny ankapobeny.

ASTM A814 347: Fantsona austenitika vita amin'ny hatsiaka ho an'ny serivisy amin'ny hafanana ambony sy ny fanodikodinana ankapobeny.

Famoronana simika 347H Stainless Steel Pipes

Stainless vy 347H Sodina toetra mekanika

Stainless vy 347H Sodina toetra ara-batana

Naoty mitovy amin'ny 347H Stainless Steel Pipe

Ny fitambaran'ny Amyloid alpha-synuclein (αS) dia famantarana ny aretin'i Parkinson sy ny synucleinopathies hafa.Vao haingana, ny proteinina tau izay matetika mifandray amin'ny aretin'i Alzheimer dia misy ifandraisany amin'ny patolojia αS ary hita fa miara-miasa amin'ny fampidirana manankarena αS, na dia mbola tsy mazava aza ny mekanika molekiola amin'ny fitambaran'ireo proteinina roa.Mitatitra eto izahay fa ny dingana αS dia misaraka amin'ny condensate ranoka amin'ny alàlan'ny condensation complex electrostatic miaraka amin'ny polypeptides misy fiampangana tsara toy ny tau.Miankina amin'ny fifandraisan'ny αS ho an'ny polycations sy ny tahan'ny fihenan'ny valence amin'ny tambajotra coagulation, ny clots dia mandalo gelation na coalescence haingana arahin'ny aggregation amyloid miadana.Amin'ny fampifangaroana teknika biofizika mandroso, dia afaka nanamarika ny fisarahan'ny αS/Tau ranoka ranoka izahay ary namaritra ireo anton-javatra manan-danja izay mitarika amin'ny fiforonan'ny aggregates heterogène misy proteinina roa ao anaty condensate proteinina ranoka.
Ho fanampin'ny efitranon'ny membrane, ny fisarahana ara-eo amin'ny sela dia azo atao ihany koa amin'ny alàlan'ny fiforonan'ny vatana matevina manankarena proteinina, toy ny ranon-javatra antsoina hoe condensate biomolecular na droplets, amin'ny alàlan'ny dingana iray antsoina hoe fisarahana amin'ny ranon-javatra (LLPS).Ireo vongan-drano ireo dia miforona amin'ny fifandraisana ara-nofo maro isan-karazany, matetika eo amin'ny proteinina na proteinina sy ny RNA, ary miasa amin'ny asa isan-karazany amin'ny saika ny rafitra velona rehetra.Be dia be ny proteinina afaka LLP mampiseho filaharan'ny fahasarotana ambany izay tena mikorontana eo amin'ny natiora sy amin'ny fananganana condensate biomolecular3,4,5.Fanadihadiana andrana maro no nampiseho ny maha-flexible, matetika mikorontana, ary multivalent ny proteinina mandrafitra ireo condensate mitovitovy amin'ny rano ireo, na dia kely aza no fantatra momba ny molekiola voafaritra manokana izay mifehy ny fitomboana sy ny fahamatoran'ireo condensate ireo ho toy ny mafy kokoa. fanjakana..
Ny angon-drakitra vaovao dia manohana ny fiheverana fa ny LLPS aterin'ny proteinina aberrant sy ny fiovan'ny vongan-drano ho rafitra matanjaka dia mety ho lalan'ny sela misy ifandraisany amin'ny fiforonan'ireo aggregates misy poizina tsy mety levona izay matetika famantarana ny aretina manimba.Proteinina intrinsically disordered (IDPs) maro mifandraika amin'ny LLPS, matetika be fiampangana sy malefaka, dia efa ela no mifandray amin'ny neurodegeneration amin'ny alàlan'ny dingan'ny fanangonana amyloid.Indrindra indrindra, ny biomolecular IDP condensates toy ny FUS7 na TDP-438 na proteinina manana sehatra be pitsiny ambany be toy ny hnRNPA19 dia naseho ho antitra amin'ny endrika gel na mafy mihitsy aza amin'ny alàlan'ny dingana antsoina hoe fluidization.fitambarana.amin'ny fifindran'ny dingana mafy (LSPT) ho toy ny fiasan'ny fotoana na ho setrin'ny fanovana sasany aorian'ny fandikana na fiovan'ny pathologically manan-danja1,7.
IDP iray hafa mifandray amin'ny LLPS ao amin'ny vivo dia Tau, proteinina mikorontana mifandray amin'ny microtubule izay ny fitambaran'ny amyloid dia voarohirohy amin'ny aretin'i Alzheimer10 fa vao haingana ihany koa dia voarohirohy tamin'ny aretina Parkinson (PD) sy ny proteinina nokleary synaptic hafa 11, 12, 13 mifandray.Nasehon'i Tau fa misaraka ho azy amin'ny vahaolana/cytoplasma noho ny fifampikasohan'ny electrostatic14, ka nahatonga ny fiforonan'ny vongan-dranon'ny tau fantatra amin'ny anarana hoe coacervates electrostatic.Voamarika ihany koa fa io karazana fifaneraserana tsy voafaritra io no hery mitarika ao ambadiky ny condensate biomolecular maro amin'ny natiora15.Raha ny proteinina tau, dia azo amboarina amin'ny alàlan'ny fanangonana tsotra ny fivondronan'ny electrostatika, ka ny faritra mifanandrify amin'ny proteinina no mahatonga ny fizotry ny cleavage, na amin'ny alàlan'ny fanangonana sarotra amin'ny alàlan'ny fifandraisana amin'ny polymère misy fiampangana ratsy toy ny RNA.
Vao haingana, ny α-synuclein (αS), ny amyloid IDP voarohirohy amin'ny PD sy ny aretina neurodegenerative hafa fantatra amin'ny anarana hoe synucleinopathy17,18, dia naseho tao amin'ny sela sy biby modely19,20 mifantoka amin'ny condensate proteinina miaraka amin'ny fihetsika toy ny fluid.Ny fandinihana in vitro dia naneho fa ny αS dia mandalo LLPS amin'ny alàlan'ny fanangonana tsotra amin'ny alàlan'ny fifandraisana hydrophobic indrindra, na dia mitaky fatran'ny proteinina avo be aza io dingana io ary ny fotoana incubation maharitra maharitra19,21.Na ny condensate misy αS hita ao amin'ny vivo dia noforonin'ity na dingana LLPS hafa dia mbola olana lehibe tsy voavaha.Toy izany koa, na dia hita ao amin'ny neurons ao amin'ny PD sy ny synucleinopathies hafa aza ny fivondronan'ny αS amyloid, dia mbola tsy fantatra mazava ny tena fomba fiasan'ny αS amin'ny fivondronan'ny amyloid intracellular, satria ny fanehoana tafahoatra an'io proteinina io dia toa tsy miteraka izany dingana izany.Ilaina matetika ny fahasimban'ny sela fanampiny, milaza fa ilaina ny toerana misy sela na microenvironment sasany amin'ny famerenana indray ny fivorian'ny αS amyloid intracellular.Ny tontolon'ny sela iray izay tena mora mitambatra dia ny ao anatin'ny condensate proteinina 23 .
Mahaliana fa ny αS sy tau dia hita fa miara-miasa amin'ny fampidirana aretina mampiavaka ny olona voan'ny aretin'i Parkinson sy ny synucleinopathies hafa 24,25 ary ny fanandramana dia nitatitra ny fifandraisan'ny synergistic pathological misy eo amin'ireo proteinina roa 26,27 izay manoro hevitra ny mety ho fifandraisana eo amin'ny aggregation αS sy tau amin'ny aretina neurodegenerative.faharariana.Ny αS sy tau dia hita fa mifandray sy mampiroborobo ny fivondronan'ny tsirairay ao anaty vitro sy in vivo 28,29 ary ny fitambarana heterogène ahitana ireo proteinina roa ireo dia voamarika ao amin'ny atidohan'ny marary voan'ny synucleinopathies 30.Na izany aza, vitsy no fantatra momba ny fototry ny molekiola amin'ny fifandraisana misy eo amin'ny αS sy tau ary ny mekanika amin'ny fiaraha-mientana.Ny αS dia voalaza fa mifandray amin'ny tau amin'ny alàlan'ny fanintonana elektrônika eo anelanelan'ny faritra C-terminal be fiampangana be loatra amin'ny αS sy ny faritra manankarena proline ao amin'ny tau, izay manankarena ihany koa amin'ny sisa tavela.
Amin'ity fandinihana ity, dia asehontsika fa ny αS dia afaka misaraka amin'ny vongan-drano amin'ny alàlan'ny condensation complex electrostatic eo anatrehan'ny proteinina tau, mifanohitra amin'ny fifandraisany amin'ny polypeptides misy fiampangana tsara toy ny poly-L-lysine (pLK), ary amin'ity dingana ity.Ny αS dia miasa toy ny molekiola scaffold ho an'ny tamba-jotra.Hitanay ny fahasamihafana hita eo amin'ny dingan'ny fahamatorana ny coacervates αS electrostatic, izay mifandray amin'ny fahasamihafana eo amin'ny valency sy ny tanjaky ny fifandraisan'ny proteinina tafiditra ao amin'ny tambajotra coacervate.Mahaliana fa nandinika ny fitambaran'ny proteinina αS sy tau amyloid izahay amin'ny coacervates ranon-javatra efa ela ary namantatra ny anton-javatra manan-danja sasany izay mitarika amin'ny fanangonana ireo proteinina roa ireo amin'ny coacervates toy izany.Eto isika dia mamaritra amin'ny an-tsipiriany ity dingana ity, izay mety ho mekanika molekiola mifototra amin'ny colocalization ny proteinina roa amin'ny fampidirana manokana aretina.
Ny αS dia manana rambony C-terminal anionika amin'ny pH tsy miandany (sary 1a), ary noheverinay fa mety handalo LLPS amin'ny alàlan'ny condensation ny complexes electrostatic miaraka amin'ny molekiola polypeptide polycationic disordered.Nampiasa poly-L-lysine (pLK) 100 sisa izahay ho molekiolan'ny maodely fanombohana noho ny toetran'ny polymeric miadana sy mikorontana amin'ny pH 32 tsy miandany. (sary 1b) mampiasa αS 13C / 15N misy marika eo anatrehan'ny fitomboan'ny αS: pLK molar ratios.Ny fifandraisan'ny pLK amin'ny Ct-domain an'ny αS dia miseho amin'ny fikorontanan'ny fiovan'ny simika sy ny fihenan'ny hamafin'ny tampony amin'ity faritra misy ny proteinina ity.Mahaliana fa rehefa nampifangaro ny αS sy ny pLK izahay tamin'ny fifantohana αS eo ho eo.5-25 µM eo anatrehan'ny polyethylene glycol (5-15% PEG-8) (mahazatra LLPS buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) avy hatrany dia nandalo sehatra midadasika fananganana proteinina. .Nojerena tamin'ny alalan'ny microscopy fluorescence (WF) sy bright-field (BF) ny droplets (sary 1c).1-5 µm droplets misy αS mivondrona (miampy 1 µM AlexaFluor488-labeled αS, AF488-αS), ny toetran'ny electrostatika dia azo avy amin'ny fanoherana ny 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) ary ny fahatsapany ny fitomboan'ny fifantohana NaCl (sary 1c).Ny toetran'ny tsiranoka amin'ny coacervates amin'ny complex electrostatic αS / pLK dia aseho amin'ny fahafahany mitambatra ao anatin'ny milisegondra (sary 1d).Amin'ny fampiasana turbidimetry, dia nandinika ny fiforonan'ny droplets eo ambanin'ireo fepetra ireo izahay, nanamafy ny toetran'ny electrostatic amin'ny fifandraisana lehibe mifandraika amin'ny fahamarinany (sary 1e), ary nanombana ny fiantraikan'ny tahan'ny polymère isan-karazany amin'ny fizotran'ny LLPS (sary 1f).Na dia tsikaritra aza ny fiforonan'ny vongan-drano amin'ny tahan'ny polymère isan-karazany, dia tena tsara ny dingana rehefa mihoatra ny αS ny pLK.Ny LLP dia voamarika ihany koa amin'ny fampiasana ny dextran-70 (70 kDa) na mampiasa endrika santionany isan-karazany, ao anatin'izany ny fitetezana fitaratra, lavadrano mikroplate misy fitaovana isan-karazany, Eppendorf na kapila quartz.
Fanehoan-kevitra momba ny faritra proteinina samihafa ao amin'ny variana WT-αS sy ΔCt-αS ampiasaina amin'ity fandalinana ity.Ny domaine amphipathic N-terminal, ny faritra hydrophobic amyloid-forming (NAC), ary ny sehatra C-terminal miiba dia aseho amin'ny manga, voasary ary mena.Ny sarintany Net Charge Per Residual (NCPR) an'ny WT-αS dia aseho.b NMR famakafakana ny fifandraisana αS / pLK amin'ny tsy fisian'ny macromolecular clumps.Rehefa mitombo ny fifantohan'ny pLK (αS: pLK molar ratios of 1: 0.5, 1: 1.5, ary 1: 10 dia aseho amin'ny maitso maitso, maitso ary maitso maitso).c Coacervate αS/pLK (molar ratio 1:10) amin'ny 25 µM (1 µM AF488-labeled αS na Atto647N-labeled pLK ho an'ny WF imaging) ao amin'ny LLPS buffer (ambony) na ampiana 500 mM NaCl (ambany havia) na aorian'ny 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; ambany havanana).Bara mizana = 20 µm.d Sarin'ny microscopic solontenan'ny BF droplet fusion an'ny αS / pLK (molar ratio 1: 10) amin'ny fifantohana 25 μM;Ny zana-tsipìka dia manondro ny fampifangaroana ny isa tsirairay (zana-tsipìka mena sy mavo) ho lasa indray mitete (zana-tsipìka voasary) ao anatin'ny 200 ms).Bara mizana = 20 µm.e Ny fanaparitahana hazavana (amin'ny 350 nm) αS / pLK aggregation ao amin'ny LLPS buffer alohan'ny sy aorian'ny fanampiana ny 500 mM NaCl na 10% 1,6-HD amin'ny 25 µM αS (N = 3 sample replika, mean and standard deviation).f BF sary (ambony) sy ny hazavana fanaparitahana fanadihadiana (ao amin'ny 350 nm, ambany) ny αS / pLK aggregation amin'ny 25 μM αS miaraka amin'ny fitomboan'ny αS: pLK molar ratio (N = 3 santionany replika, mean sy standard deviation voalaza ihany koa).Scale bar = 10 µm.Ny bara mizana eo amin'ny sary iray dia manondro ny maridrefin'ny sary rehetra ao anaty tontonana iray.Ny angona manta dia omena amin'ny endrika rakitra data manta.
Miorina amin'ny fandinihanay ny αS / pLK electrostatic complex condensation sy ny fandinihana teo aloha momba ny αS ho molekiola mpanjifa ny tau / RNA condensate amin'ny alàlan'ny fifandraisana mivantana amin'ny tau31, dia nihevitra izahay fa ny αS sy tau dia afaka misaraka amin'ny solvent raha tsy misy RNA. condensation.amin'ny alàlan'ny complexes electrostatic, ary ny αS dia proteinina scaffold ao amin'ny coacervates αS / Tau (jereo ny fizarana tau charge ao amin'ny sary 2e).Hitanay fa rehefa nafangaro tao anaty buffer LLPS ny 10 μM αS sy 10 μM Tau441 (misy 1 μM AF488-αS sy 1 μM Atto647N-Tau, tsirairay avy) dia namorona aggregate proteinina misy proteinina roa izy ireo, araka ny hitan'ny microscopy WF.(sary 2a).Ny colocalization ny proteinina roa ao amin'ny vongan-dranomandry dia nohamafisin'ny mikroskopika confocal (CF) (fanampiny sary 1a).Ny fihetsika mitovy amin'izany dia voamarika rehefa nampiasaina ny dextran-70 ho toy ny aggregation agent (fanampiny sary 1c).Amin'ny fampiasana ny PEG na ny dextran misy marika FITC, dia hitanay fa samy nizarazara tamin'ny santionany ireo mpiasan'ny olona marobe, izay tsy mampiseho ny fisarahana na ny fikambanana (Fig. 1d fanampiny).Raha ny tokony ho izy, dia manoro hevitra fa ao anatin'ity rafitra ity dia mampiroborobo ny fisarahana amin'ny alàlan'ny fiantraikan'ny macromolecular crowding izy ireo, satria ny PEG dia mpiasan'ny fihoaram-pefy tsara kokoa, araka ny hita amin'ny rafitra LLP hafa33,34.Ireo tsiranoka manankarena proteinina ireo dia saro-pady amin'ny NaCl (1 M) fa tsy amin'ny 1,6-HD (10% v / v), manamafy ny toetran'izy ireo electrostatic (fanampiny sary 2a, b).Ny fihetsik'izy ireo amin'ny fluid dia nohamafisina tamin'ny fijerena ny fisehoan-javatra millisecond mitambatra amin'ny alàlan'ny microscopy BF (sary 2b).
Ny sary mikroskopika Confocal (CF) an'ny αS / Tau441 dia mitambatra ao amin'ny buffer LLPS (10 μM isaky ny proteinina, 0.5 μM amin'ny AF488-labeled αS sy Atto647N-marika Tau441).b Sarin'ny fifanoheran'ny interference differential (DIC) amin'ny hetsika fusion droplet αS / Tau441 (10 μM ho an'ny proteinina tsirairay).c Diagrama dingana mifototra amin'ny fiparitahan'ny hazavana (amin'ny 350 nm) an'ny Tau441 LLPS (0–15 µM) amin'ny tsy fisiana (ankavia) na ny fisian'ny (ankavanana) amin'ny 50 µM αS.Ny loko mafana kokoa dia manondro fiparitahana bebe kokoa.d Ny fanaparitahana hazavana amin'ny santionany αS / Tau441 LLPS miaraka amin'ny fitomboan'ny αS (Tau441 amin'ny 5 µM, N = 2-3 famerenana santionany araka ny voalaza).e Fanehoan-kevitra momba ny karazana proteinina tau sasany sy faritra samihafa amin'ny proteinina ampiasaina amin'ity fandalinana ity: domaine N-terminal (mena), faritra manankarena proline (manga), domain microtubule-binding (MTBD, misongadina amin'ny volomboasary), ary spiral-miforona amyloid mpivady.faritra filamenta (PHF) hita ao anatin'ny MTBD (gray).Ny sarintany Net Charge Per Residue (NCPR) an'ny Tau441 dia aseho.f Mampiasa 1 µM AF488-labeled αS sy Atto647N-labeled ΔNt-, mampiasa 1 µM AF488-labeled αS na ΔCt-αS eo anatrehan'ny ΔNt-Tau (ambony, 10 µM isaky ny proteinina) na K18 (ambany, 50 µM ) ) ) micrographs an'ny WF miforitra ao anaty buffer LLPS na K18.Ny bara mizana amin'ny sary iray dia maneho ny refin'ny sary rehetra ao anaty tontonana iray (20 µm ho an'ny takelaka a, b ary f).Ny angona manta ho an'ny tontonana c sy d dia omena ho rakitra angona manta.
Mba hitsapana ny anjara asan'ny αS amin'ity dingana LLPS ity, dia nanadihady voalohany ny fiantraikan'ny αS amin'ny fahamarinan'ny droplet amin'ny alàlan'ny nephelometry amin'ny fampiasana ny fitomboan'ny NaCl (sary 2c).Arakaraky ny haavon'ny fatran'ny sira ao amin'ny santionany misy αS, ny avo kokoa ny soatoavina fanaparitahana hazavana (amin'ny 350 nm), izay manondro ny andraikitry ny αS amin'ity rafitra LLPS ity.Misy fiantraikany mitovy amin'izany dia azo jerena amin'ny fampitomboana ny fifantohana αS (ary noho izany ny tahan'ny αS:Tau441) ho eo ho eo.Mitombo 10 heny raha oharina amin'ny fifantohana tau (5 µM) (sary 2d).Mba hampisehoana fa ny αS dia proteinina scaffold ao amin'ny coacervates, dia nanapa-kevitra izahay ny hanadihady ny fitondran-tenan'ny Tau mutant voakorontana LLPS, izay tsy manana faritra N-terminal tsy misy fiampangana (sisa 1-150, jereo ny sary 2e) antsoina hoe ΔNt-Tau.Ny microscopy sy ny nephelometry WF dia nanamafy fa ny ΔNt-Tau dia tsy nandalo LLPS (sary 2f sy fanampiny 2d), araka ny voalaza teo aloha 14. Na izany aza, rehefa nampiana ny αS ny vahaolana fanaparitahana an'ity variana Tau voatapaka ity dia tanteraka ny fizotran'ny LLPS. naverina tamin'ny hakitroky ny vongan-drano akaikin'ny hakitroky ny vongan'ny vahaolana feno habe amin'ny Tau sy αS amin'ny toe-javatra mitovy amin'izany sy ny habetsahan'ny proteinina.Ity dingana ity dia azo jerena ihany koa ao anatin'ny toe-javatra misy ny fihanaky ny macromolecular ambany (sary fanampiny 2c).Ny anjara asan'ny faritra C-terminal αS, fa tsy ny halavany manontolo, ao amin'ny dingan'ny LLPS dia naseho tamin'ny alàlan'ny fanakanana ny fananganana droplet amin'ny fampiasana variana αS voatapaka C-terminal tsy misy residues 104-140 (sary 1a) amin'ny (ΔCt- αS) proteinina (sary 2f sy Fig. 2d fanampiny).Ny kolokalisasi ny αS sy ny ΔNt-Tau dia nohamafisin'ny mikroskopika fluorescence confocal (sary fanampiny 1b).
Mba hitsapana bebe kokoa ny mekanika LLPS eo anelanelan'ny Tau441 sy αS, dia nampiasaina ny variana Tau fanampiny, izany hoe ny sombintsombiny helical filament core (PHF) mitambatra ao amin'ny microtubule-binding domain (MTBD), izay raha misy sehatra efatra miverimberina, fantatra ihany koa. toy ny ampahany K18 (jereo ny sary 2e).Vao haingana no voalaza fa ny αS dia mifatotra amin'ny proteinina tau izay hita ao amin'ny sehatra manankarena proline amin'ny filaharana izay mialoha ny domaine microtubule.Na izany aza, ny faritra PHF dia manankarena amin'ny sisa tavela tsara (jereo ny sary 2e), indrindra ny lysine (15% residues), izay nanosika anay hitsapa raha ity faritra ity koa dia mandray anjara amin'ny condensation ny complex αS / Tau.Hitanay fa ny K18 irery dia tsy afaka miteraka LLPS amin'ny fifantohana hatramin'ny 100 μM eo ambanin'ny fepetra nosedraina (buffer LLPS miaraka amin'ny 15% PEG na 20% dextran) (sary 2f).Na izany aza, rehefa nampiana 50 µM αS ho 50 µM K18 izahay, ny fananganana haingana ny vongan-proteinina misy K18 sy αS dia voamariky ny nephelometry (Fig. 2d fanampiny) sy WF microscopy (sary 2f).Araka ny efa nampoizina, ny ΔCt-αS dia tsy afaka namerina ny fitondran-tenan'ny LLPS an'ny K18 (sary 2f).Marihina fa ny aggregation αS/K18 dia mitaky fatran'ny proteinina kely kokoa mba hahatonga ny LLPS raha oharina amin'ny αS/ΔNt-Tau na αS/Tau441, zavatra hafa mitovy.Izany dia mifanaraka amin'ny fifandraisana matanjaka kokoa amin'ny faritra αS C-terminal miaraka amin'ny sehatra Tau manankarena proline raha oharina amin'ny sehatra microtubule-binding, araka ny voalaza teo aloha 31.
Raha jerena fa tsy afaka manao LLPS ny ΔNt-Tau raha tsy misy ny αS, dia nisafidy ity variana Tau ity izahay ho modely amin'ny famaritana ny αS / Tau LLPS noho ny fahatsoran'ny rafitra LLPS miaraka amin'ny Tau (isotype, Tau441 / Tau441).miaraka amin'ny fizotry ny fanangonana sarotra (heterotypic, αS/Tau441).Nampitahainay ny haavon'ny αS aggregation (amin'ny ampahany amin'ny proteinina phase condensed, fαS, c) ao amin'ny rafitra αS / Tau sy αS / ΔNt-Tau amin'ny alàlan'ny centrifugation sy dispersed phase SDS-PAGE analysis (jereo ny 2e), dia nahita sanda mitovy. ho an'ny proteinina rehetra amin'ny fifantohana mitovy.Indrindra indrindra, nahazo fαS, c 84 ± 2% ary 79 ± 7% ho an'ny αS / Tau sy αS / ΔNt-Tau isika, izay manondro fa ny fifandraisana heterotypic eo amin'ny αS sy tau dia ambony noho ny fifandraisana misy eo amin'ny molekiola tau.eo anelanelan'ny.
Ny fifandraisana amin'ny polycations isan-karazany sy ny fiantraikan'ny fizotry ny condensation amin'ny kinetika αS dia nodinihina voalohany tamin'ny fomba fanarenana ny fluorescence taorian'ny fomba famafazana (FRAP).Nosedrainay ny αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau ary αS / pLK coacervates (100 μM αS nampiana 2 μM αS AF488-αS sy 100 μM Tau441 na ΔNt-Tau na 1 mM pLK).Ny angona dia azo tao anatin'ny 30 minitra voalohany taorian'ny fampifangaroana ireo singa santionany.Avy amin'ny sary FRAP solontena (sary 3a, condensation αS / Tau441) sy ny curves mifanaraka amin'izany (sary 3b, Fig. 3 fanampiny), dia hita fa mitovy amin'ny an'ny Tau441 coacervates ny kinetika αS.ary ΔNt-Tau, izay haingana kokoa amin'ny pLK.Ny kajy diffusion coefficients ho an'ny αS ao anatin'ny coacervate araka ny FRAP (araka ny nofaritan'i Kang et al. 35) dia D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ary D = 0.026 ± 0.008 µm2/s ho an'ny αS/TauS/s ho an'ny αS/TauS441 ny αS/system.pLK, Tau, ary D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, tsirairay avy (sary 3c).Na izany aza, ny diffusion coefficient αS ao amin'ny dispersed phase dia maromaro ny halehiben'ny halehiben'ny avo kokoa noho ny condensed phases rehetra, araka ny voafaritra amin'ny Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, jereo fanampiny Fig. 3) eo ambanin'ny fepetra mitovy (LLPS buffer) fa amin'ny tsy fisian'ny polycations ( D = 8 ± 4 µm2/s).Noho izany, ny kinetika amin'ny fandikan-teny αS dia mihena be amin'ny coacervates raha oharina amin'ny proteinina ao amin'ny dingana miparitaka noho ny fiantraikan'ny molekiolan'ny molekiola, na dia ny coacervates rehetra aza dia mitazona fananana toy ny rano mandritra ny antsasak'adiny voalohany aorian'ny fananganana azy, mifanohitra amin'ny dingana tau.kinetika haingana kokoa amin'ny condensate pLK.
a-c FRAP fanadihadiana momba ny dinamika αS (2% AF488-labeled αS) amin'ny coacervates electrostatic.Ny sarin'ny solontenan'ny αS / Tau441 FRAP assays amin'ny triplicate dia aseho ao amin'ny (a), izay misy faribolana mena manondro faritra tsy misy loko.Ny haavon'ny haavony dia 5 µm.b salantsalany FRAP curves sy (c) kajy diffusion coefficients (D) ho an'ny 5-6 (N) droplets samihafa avy amin'ny fanandramana telo mampiasa 100 µM αS sy equimolar concentrations ny Tau441 (mena) na ΔNt-Tau (manga) na pLK (maitso) amin'ny avo folo heny ny fifantohana amin'ny LLPS.Ny fivilian-dàlana mahazatra amin'ny curve FRAP dia aseho amin'ny loko alokaloka.Ho fampitahana, ny diffusion coefficient αS ao amin'ny dispersed phase dia voafaritra amin'ny triplicate amin'ny fampiasana fluorescence correlation spectroscopy (FCS) (jereo ny sary fanampiny 3 sy ny fomba hahazoana fampahalalana bebe kokoa).d EPR spectra X-band mitohy amin'ny 100 μM TEMPOL-122-αS amin'ny buffer LLPS tsy misy polycation (mainty) na eo anatrehan'ny 100 μM Tau441 (mena) na ΔNt-Tau (manga) na 1 mM pLK (maitso).Ny sisiny dia mampiseho fomba fijery lehibe momba ny tsipika an-tsaha matanjaka izay misy ny fiovana manaitra indrindra.e Famatorana curve 50 μM TEMPOL-122-αS miaraka amin'ny polycations isan-karazany amin'ny tsy fisian'ny LLPS (tsy misy PEG).Ny fihenan'ny amplitude amin'ny tarika III raha oharina amin'ny tarika II (IIII / III) amin'ny spectrum EPR mahazatra dia aseho fa mampitombo ny tahan'ny molar amin'ny Tau441 (mena), ΔNt-Tau (manga) ary pLK (maitso).Ny tsipika miloko dia mampiseho fa mety amin'ny angon-drakitra amin'ny fampiasana maodely mifamatotra henjana miaraka amin'ny toerana mamatotra mitovy sy tsy miankina amin'ny curve tsirairay.Ny angona manta dia omena amin'ny endrika rakitra data manta.
Ho famenoana, dia nanadihady ny dinamikan'ny αS amin'ny coacervates isan-karazany izahay tamin'ny alàlan'ny fametahana spin (SDSL) sy ny resonance paramagnetic electron mitohy (CW-EPR).Ity fomba ity dia voaporofo fa tena ilaina amin'ny fitateram-baovao ny fahafaha-manao sy ny fihetsehan'ny IDP miaraka amin'ny fanapahan-kevitra sisa tavela36,37,38.Ho an'ity tanjona ity, dia nanamboatra ny sisa tavela amin'ny cystine amin'ny mutant Cys tokana izahay ary nampiasa ny probe spin 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Ny derivatives maleimide dia mametaka azy ireo.Amin'ny ankapobeny, nampiditra probe TEMPOL amin'ny toerana 122 na 24 αS (TEMPOL-122-αS sy TEMPOL-24-αS) izahay.Amin'ny tranga voalohany, mikendry ny faritra C-terminal ny proteinina isika, izay tafiditra amin'ny fifandraisana amin'ny polycation.Fa kosa, ny toerana 24 dia afaka manome antsika fampahalalana momba ny dinamika ankapobeny ny proteinina ao amin'ny condensate.Amin'ireo tranga roa ireo, ny mari-pamantarana EPR azo amin'ny proteinina amin'ny dingana miparitaka dia mifanitsy amin'ny radical nitroxide amin'ny fanjakana mihetsika haingana.Taorian'ny fisarahan'ny dingana eo anatrehan'ny tau na pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 na ΔNt-Tau amin'ny tahan'ny 1: 1 na pLK amin'ny tahan'ny 1:10), dia hita ny fitomboan'ny haavon'ny tampon'ny haavony. Ny vidin'ny EPR amin'ny αS.Nivelatra ny tsipika fatiantoka, manondro ny fihenan'ny kinetika reorientation αS amin'ny droplets raha oharina amin'ny proteinina amin'ny dilute (sary 3d, Fig. 4a fanampiny).Ireo fiovana ireo dia mibaribary kokoa amin'ny toerana 122. Raha eo amin'ny toerana 24 ny fisian'ny pLK dia tsy misy fiantraikany amin'ny kinetika amin'ny probe, amin'ny toerana 122 dia niova be ny endriky ny tsipika (sary fanampiny 4a).Rehefa nanandrana nanamboatra ny spectra amin'ny toerana 122 amin'ny rafitra αS / polycation roa izahay amin'ny fampiasana ny modely isotropika (sary fanampiny 5a) izay matetika ampiasaina hamaritana ny dinamika amin'ny IDP38,39 misy marika, dia tsy afaka nanamboatra ny spectra fanandramana izahay..Ny simulation spectral amin'ny toeran'ny 24 spins mifanohitra (fanampiny sary 5a).Izany dia manondro fa misy toerana manokana eo amin'ny habaka fanodinkodinana ny faritra C-terminal an'ny αS amin'ny fisian'ny polycations.Rehefa mandinika ny ampahany amin'ny αS ao amin'ny dingana condensed eo ambanin'ny fepetra EPR fanandramana (84 ± 2%, 79 ± 7%, ary 47 ± 4% ho an'ny αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, ary αS / pLK, tsirairay avy - jereo ny Fanampiny Sary 2e momba ny famakafakana data c), dia hita fa ny fanitarana hita amin'ny fomba EPR dia maneho indrindra ny fifandraisan'ny faritra C-terminal an'ny αS miaraka amin'ny polycations isan-karazany ao amin'ny dingana condensed (ny fiovana lehibe rehefa mampiasa TEMPOL-122- αS), fa tsy condensation proteinina.Ny fitomboan'ny microviscosity dia hita ao amin'ny probe.Araka ny efa nampoizina, ny EPR spectrum ny proteinina ao anatin'ny toe-javatra hafa ankoatry ny LLPS dia naverina tamin'ny laoniny tanteraka rehefa nampiana 1 M NaCl ny fifangaroana (fanampiny sary 4b).Amin'ny ankapobeny, ny angon-drakitray dia manoro hevitra fa ny fiovana hitan'ny CW-EPR dia maneho indrindra ny fifaneraserana amin'ny faritra C-terminal an'ny αS miaraka amin'ny polycations isan-karazany ao amin'ny dingana mitongilana, ary io fifandraisana io dia toa matanjaka kokoa amin'ny pLK noho ny Tau.
Mba hahazoana fampahalalana ara-drafitra bebe kokoa momba ny proteinina ao amin'ny coacervate, dia nanapa-kevitra ny hianatra ny rafitra LLPS mampiasa NMR amin'ny vahaolana izahay.Na izany aza, ny ampahany αS sisa tavela ao amin'ny dingana miparitaka ihany no azontsika fantarina, izay mety ho noho ny fihenan'ny dinamika proteinina ao anatin'ny coacervate sy ny dingana matevina eo amin'ny farany ambany amin'ny vahaolana amin'ny famakafakana NMR.Rehefa nandinika ny rafitra sy ny dinamikan'ny proteinina sisa tavela ao amin'ny dingana miparitaka amin'ny santionan'ny LLPS izahay amin'ny fampiasana NMR (sary fanampiny 5c, d), dia nahatsikaritra fa ny proteinina dia nitovy tamin'ny fisian'ny pLK sy ΔNt-Tau, samy izay tao amin'ny rafitra faharoa sy ny dinamikan'ny taolam-paty proteinina, nasehon'ny fanandramana momba ny fiovan'ny simika faharoa sy ny fialan-tsasatra R1ρ.Ny angon-drakitra NMR dia mampiseho fa ny C-terminus an'ny αS dia mijaly noho ny fahaverezan'ny flexibilité conformational raha mitazona ny toetrany mikorontana, toy ny ambiny amin'ny filaharan'ny proteinina, noho ny fifandraisany amin'ny polycations.
Koa satria ny fanitarana famantarana CW-EPR hita ao amin'ny TEMPOL-122-αS condensed phase dia maneho ny fifandraisan'ny proteinina amin'ny polycations, dia nanao titration EPR izahay mba hanombanana ny fifandraisan'ny αS amin'ny polycations isan-karazany raha tsy misy ny LLPS (tsy misy fanangonana ny Buffer LLPS), manoro hevitra fa ny fifandraisana dia mitovy amin'ny dilute sy concentrate phases (izay nohamafisin'ny angonay, Fig. 4a fanampiny ary Fig. 6 fanampiny).Ny tanjona dia ny hijerena raha toa ny coacervates rehetra, na dia eo aza ny toetrany mitovy amin'ny fluid, dia mampiseho fitondran-tena tsy mitovy amin'ny ambaratonga molekiola.Araka ny efa nampoizina, ny EPR spectrum dia nivelatra tamin'ny fitomboan'ny fifantohana polycation, izay mampiseho ny fihenan'ny flexibility molekiola noho ny fifandraisan'ny molekiola amin'ny mpiara-miombon'antoka amin'ny fifandraisana saika amin'ny saturation (sary 3e, sary fanampiny 6).Ny pLK dia nahatratra ity saturation ity tamin'ny tahan'ny molar ambany kokoa (polycation:αS) raha oharina amin'ny ΔNt-Tau sy Tau441.Raha ny marina, ny fampitahana ny angon-drakitra miaraka amin'ny maodely mifamatotra eo ho eo amin'ny fiheverana ny tranokala mitovitovy sy mahaleo tena dia nampiseho fa ny tsy fitoviana mibaribary amin'ny pLK (~ 5 μM) dia lamina ambany kokoa noho ny an'ny Tau441 na ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Na dia tombanana henjana aza izany, dia manondro fa ny αS dia manana fifandraisana ambony kokoa amin'ny polycations tsotra kokoa miaraka amin'ny faritra fiampangana tsara mitohy.Raha jerena io fahasamihafana eo amin'ny fifandraisana misy eo amin'ny αS sy ny polycations isan-karazany, dia nihevitra izahay fa mety hiova amin'ny fomba hafa ny toetran'izy ireo rehefa mandeha ny fotoana ary noho izany dia mijaly amin'ny fizotran'ny LSPT samihafa.
Raha jerena ny tontolo feno olona ao anatin'ny coacervate proteinina sy ny toetran'ny proteinina amyloid, dia nandinika ny fihetsiky ny coacervate izahay rehefa nandeha ny fotoana mba hahitana ny fizotran'ny LSPT.Amin'ny fampiasana mikroskopika BF sy CF (sary 4), dia hitanay fa ny αS / Tau441 dia mitambatra amin'ny vahaolana lehibe, mamorona vongan-drano lehibe mifandray sy mando ny eny amin'ny faran'ny lavaka fantsakana ho toy ny vongan-drano feno, araka ny efa nampoizina (Fig fanampiny). 7d);antsoina hoe “rafts proteinina” ireo rafitra miforona ambany ireo.Ireo rafitra ireo dia nijanona ho tsiranoka rehefa nitazona ny fahafahana mitambatra (Fig. 7b fanampiny) ary azo jerena mandritra ny ora maromaro taorian'ny nanombohan'ny LLPS (sary 4 sy Fig. 7c fanampiny).Hitanay fa ny fizotry ny wetting dia ankasitrahana eo amin'ny ambonin'ny hydrophilic fa tsy hydrophobic fitaovana (fanampiny Fig. 7a), araka ny antenaina ho electrostatic coacervates amin'ny fiampangana tsy voalanjalanja ary noho izany avo electrostatic ambonin'ny mety.Marihina fa nihena be ny coalescence αS/ΔNt-Tau sy ny rafting, raha nihena be kosa ny condensate αS/pLK (sary 4).Nandritra ny fotoana fohy incubation, ny αS / pLK droplets dia afaka nitambatra sy nandoto ny hydrophilic ambonin'ny, fa ity dingana ity dia nijanona haingana ary taorian'ny 5 ora incubation, dia voafetra ihany ny hetsika coalescence ary tsy misy mando.- fifindran'ny gel-drip.
Solontena BF (panneaux grayscale) sy CF (panneaux havanana, AF488-marika αS amin'ny maitso) santionany coacervate misy 100 µM αS (1% fluorescent label) ao amin'ny buffer LLPS eo anatrehan'ny 100 µM Tau441 (ambony) sary fluorescence ΔNt microscopic. -Tau (afovoany) na 1 mM pLK (ambany) amin'ny fotoana incubation samy hafa sy ny haavon'ny focal (z, halavirana amin'ny faran'ny lovia).Ny fanandramana dia naverina in-4-6 tsy miankina miaraka amin'ny vokatra mitovy.Ny coacervates αS/Tau441 dia kobanina rehefa afaka 24 ora, ka mamorona rafts lehibe kokoa noho ny sary.20 µm ny bara mizana ho an'ny sary rehetra.
Nanontany izahay avy eo raha ny dobo proteinina lehibe miforona ao amin'ny αS / Tau441 LLPS dia mety hitarika amin'ny fanangonana amyloid amin'ny proteinina nodinihina.Nanaraka ny fahamatorana αS / Tau441 izahay rehefa mandeha ny fotoana miaraka amin'ny microscopy WF amin'ny toe-javatra mitovy amin'ny etsy ambony, fa mampiasa 1 μM AF488 misy marika αS sy Atto647N misy marika Tau441 (sary 5a).Araka ny efa nampoizina, dia nahita toerana feno proteinina izahay nandritra ny fizotran'ny fahamatorana.Mahaliana fa avy amin'ny ca.Taorian'ny adiny 5, dia nisy rafitra tsy mitongilana mahery vaika hita tao anatin'ireo rafts, izay nantsoinay hoe "teboka", ny sasany dia nalaina tamin'ny αS, ary ny sasany dia nanan-karena tamin'ny Tau441 (sary 5a, zana-tsipìka fotsy).Ireo teboka ireo dia voamarika hatrany amin'ny rafts ho an'ny αS/ΔNt-Tau noho ny an'ny αS/ΔNt-Tau.Tsy nisy teboka miavaka amin'ny ranon-tsavony amin'ny rafitra pLK sy Tau izay tsy mahay mitambatra / mando.Mba hitsapana raha ireo tasy misy αS sy Tau441 ireo dia aggregate mitovy amin'ny amyloid, dia nanao fanandramana mitovy amin'izany izahay tamin'ny fampiasana mikroskopika CF izay nasiana marika Tau441 miaraka amin'ny Atto647N ary 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) dia nampiana hatrany am-piandohana.loko.Na dia tsy voamarika aza ny fametahana ThT an'ny αS / Tau441 na rafts na dia taorian'ny 24 h incubation (sary 5b, laharana ambony - ny sisa tavela amin'ny rafts proteinina), ny rafitra ThT-positive misy Atto647N-Tau441 ao anatin'ny rafts dia tena malemy.izany dia mamerina ny habeny, ny endriny ary ny toerana misy ireo teboka voalaza teo aloha (sary 5b, andalana afovoany sy ambany), izay manondro fa ny teboka dia mety mifanandrify amin'ny fitambarana amyloid miforona ao amin'ny coacervates fluida efa antitra.
WF 25 μM αS amin'ny fotoana incubation isan-karazany sy ny haavon'ny focal (z, halavirana amin'ny ambany tsy mifatotra) eo anatrehan'ny 25 μM Tau441 (1 μM AF488-labeled αS sy Atto647N-marika Tau441) ao anaty lavadrano misy takelaka mikraoskaopy misy buffer LLPS) .Andrana enina no naverina tsy miankina nisy valiny mitovy.b CF sary mikroskopika amin'ny 25 μM αS eo anatrehan'ny 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-marika Tau441) ary 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Aseho eo amin'ny laharana ambony sy afovoany ny tadin'ny proteinina voalanja sy ny rafts sy ny pentina proteinina napetraka.Ny laharana ambany dia mampiseho sarin'ny rafts sy latsaka avy amin'ny replika tsy miankina 3.Ny zana-tsipìka fotsy dia manondro teboka ThT-positive amin'ny takelaka roa.20 µm ny bara mizana ho an'ny sary rehetra.
Mba handinihana amin'ny antsipiriany bebe kokoa ny fiovana ao amin'ny tambajotra proteinina coacervate nandritra ny fifindrana avy amin'ny ranoka mankany amin'ny solid, dia nampiasa fluorescence lifetime imaging (FLIM) sy Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (sary 6 sy Sary fanampiny 8 sy 9).Noheverinay fa ny fahamatorana coacervate ny sosona ho lasa firafitry ny proteinina mivondrona kokoa na mivaingana toy ny mivaingana aza dia mitarika fifandraisana akaiky kokoa eo amin'ny proteinina sy ny probe fluorescent miraikitra aminy, ka mety hiteraka voka-dratsiny miseho amin'ny androm-piainan'ny probe fohy (τ) , araka ny voalaza teo aloha40.,41 ,42.Ho fanampin'izany, ho an'ny santionany misy marika roa (AF488 sy Atto647N ho mpanome FRET sy loko acceptor, tsirairay avy), io fihenan'ny τ io dia azo ampiarahana amin'ny condensation coacervate sy ny fitomboan'ny fahombiazan'ny FRET(E) mandritra ny LSPT.Nanara-maso ny fananganana raft sy spot izahay tamin'ny fotoana tao amin'ny santionany LLPS αS / Tau441 sy αS / ΔNt-Tau (25 µM amin'ny proteinina tsirairay ao amin'ny buffer LLPS misy 1 µM AF488 misy marika αS sy / na Atto647N misy marika Tau441 na ΔNt-Tau).Hitanay ny fironana amin'ny ankapobeny fa ny androm-piainan'ny fluorescence an'ny AF488 (τ488) sy ny Atto647N (τ647N) dia nihena kely rehefa matotra ny coacervates (sary 6 sy fanampiny 8c).Mahaliana fa io fiovana io dia nohatsaraina be dia be ho an'ny teboka ao anatin'ny rafts (sary 6c), izay manondro fa nisy ny condensation proteinina fanampiny nitranga tamin'ny teboka.Ho fanohanana izany dia tsy nisy fiovana lehibe teo amin'ny androm-piainan'ny fluorescence hita ho an'ny droplets αS / ΔNt-Tau efa antitra nandritra ny 24 h (Fig. 8d fanampiny), izay manoro hevitra fa ny gelation droplet dia dingana iray miavaka amin'ny spotting ary tsy miaraka amin'ny fanavaozana molekiola manan-danja. ao anatin'ny coacervates.Tsara homarihina fa ny teboka dia manana habe sy votoaty miovaova ao amin'ny αS, indrindra ho an'ny rafitra αS / Tau441 (Fig. 8e fanampiny).Ny fihenan'ny androm-piainan'ny fluorescence dia niaraka tamin'ny fitomboan'ny hamafin'ny, indrindra ho an'ny Atto647N misy soratra Tau441 (Fig. 8a fanampiny), ary ny fahombiazan'ny FRET ambony kokoa ho an'ny rafitra αS / Tau441 sy αS / ΔNt-Tau, izay manondro ny condensation fanampiny ao amin'ny LLPS Dimy ora. taorian'ny trigger dia nifandona ny proteinina ao anatin'ny herinaratra static.Raha ampitahaina amin'ny αS / ΔNt-Tau, dia nahita sanda τ647N ambany izahay ary somary ambony kokoa τ488 amin'ny teboka αS / Tau441, miaraka amin'ny sanda FRET ambany kokoa sy tsy mitovy.Mety misy ifandraisany amin'ny hoe ao amin'ny rafitra αS / Tau441, ny habetsahan'ny αS voamarika sy antenaina amin'ny fitambarana dia heterogène kokoa, matetika substoichiometric raha ampitahaina amin'ny Tau, satria ny Tau441 dia mety hiharan'ny LLPS sy ny aggregation ihany koa (Fig. 8e fanampiny) .Na izany aza, ny haavon'ny coalescence droplet, ny fananganana raft, ary, ny zava-dehibe, ny fitambaran'ny proteinina ao anatin'ny coacervates toy ny ranoka dia ambony indrindra rehefa misy Tau441 sy αS.
sarin'ny αS / Tau441 sy αS / ΔNt-Tau amin'ny 25 μM amin'ny proteinina tsirairay (1 μM AF488-labeled αS sy 1 μM Atto647N-labeled Tau441 na ΔNt-Tau) ao amin'ny buffer LLPS.Ny tsanganana dia mampiseho sary solontenan'ny santionany LLPS amin'ny fotoana fahamatorana samihafa (30 min, 5 ora ary 24 ora).Ny frame mena dia mampiseho ny faritra misy pentina αS/Tau441.Ny halavan'ny fiainana dia aseho ho toy ny bara miloko.Scale bar = 20 µm ho an'ny sary rehetra.b Sarin'ny FLIM natao zoom amin'ny faritra voafantina, aseho amin'ny boaty mena eo amin'ny tontonana a.Ny fari-piainana dia aseho amin'ny fampiasana ny maridrefy loko mitovy amin'ny tontonana a.Bara mizana = 5 µm.c Histograms mampiseho AF488 (mifamatotra amin'ny αS) na Atto647N (miraikitra amin'ny Tau) ho an'ny karazana proteinina samihafa (droplets-D-, raft-R- ary speckle-P) hita ao amin'ny sary FLIM voarakitra ho an'ny αS-) fizarana fotoana mandritra ny androm-piainan'ny Tau441 sy Santionany coacervate αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI ho an'ny D, 29-44 ROI ho an'ny R, ary 21-51 ROI ho an'ny teboka).Ny sanda median sy median dia aseho ho efamira mavo sy tsipika mainty ao anaty boaty.Ny sisiny ambany sy ambony amin'ny boaty dia maneho ny quartile voalohany sy fahatelo, ary ny sanda kely indrindra sy ambony indrindra ao anatin'ny 1.5-fold interquartile range (IQR) dia aseho ho volombava.Ny outliers dia aseho ho diamondra mainty.Ny lanjan'ny statistika eo amin'ny fizarana tsiroaroa dia nofaritana tamin'ny fampiasana t-test santionany roa, amin'ny fiheverana ny tsy fitoviana tsy mitovy.Ny sanda-t-test roa-rambony dia aseho miaraka amin'ny asterisk ho an'ny data roa ampitahaina (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value> 0,00001), ns dia manondro ny tsy fahampiana (p-value> 0,05).Ny sanda p marina dia omena ao amin'ny tabilao fanampiny 1, ary ny angon-drakitra tany am-boalohany dia aseho ho rakitra data manta.
Mba hanehoana bebe kokoa ny toetran'ny amyloid amin'ny speckles / aggregates, dia nokarakarainay ny santionany coacervate tsy voapoizina nandritra ny 24 ora miaraka amin'ny fifantohana avo amin'ny (1 M) NaCl, izay niafara tamin'ny fisarahana ny aggregate avy amin'ny coacervates proteinina.Rehefa voamarika tamin'ny alalan'ny microscopy atomika (AFM) ny fitambarana mitoka-monina (izany hoe, vahaolana miparitaka amin'ny aggregate) dia hitanay ny morphologie spherical be indrindra miaraka amin'ny haavo tsy tapaka eo amin'ny 15 nm, izay matetika mifandray amin'ny toe-javatra misy sira avo lenta, mitovy amin'ny ny fitondran-tenan'ny fibrils amyloid mahazatra noho ny fiantraikan'ny hydrophobic mahery eo amin'ny tany (mariho fa matetika ny fibrils dia manana haavo ~ 10 nm) (sary fanampiny 10a).Mahavariana fa rehefa nipoitra tamin'ny ThT ny ​​aggregates mitoka-monina amin'ny fitiliana fluorescence ThT mahazatra, dia nahita fitomboana be ny ThT fluorescence quantum yield, azo ampitahaina amin'ny voamarika rehefa nopotehina tamin'ny fibrils amyloid αS mahazatra (fanampiny sary 10b) ny loko. Ny fitambaran'ny coacervate dia misy rafitra toy ny amyloid..Raha ny marina, ny aggregates dia nandefitra tamin'ny habetsahan'ny sira avo lenta fa mora amin'ny 4 M guanidine chloride (GdnHCl), toy ny fibrils amyloid mahazatra (Fig. 10c fanampiny).
Manaraka, dia nandinika ny firafitry ny aggregates mampiasa fluorescence molekiola tokana, fluorescence correlation manokana / cross-correlation spectroscopy (FCS / FCCS), ary ny fipoahana fanadihadiana ny roa-loko kisendrasendra detection (TCCD).Ho an'ity tanjona ity dia natokanay ny aggregates niforona taorian'ny 24 ora incubation ao amin'ny 100 μl LLPS santionany misy αS sy Tau441 (samy 25 μM) miaraka amin'ny 1 μM AF488-marika αS sy 1 μM Atto647N-marika Tau441.Alefaso ny vahaolana aggregate miparitaka any amin'ny fanjakana monomolecular amin'ny fampiasana ny buffer tsy misy PEG sy 1 M NaCl (ilay buffer ampiasaina hanasarahana ny aggregate amin'ny coacervate) mba hisorohana izay mety ho fifandraisana electrostatika eo amin'ny LLPS sy proteinina.Ohatra iray amin'ny lalan'ny molekiola tokana dia hita ao amin'ny sary 7a.Ny fanadihadiana FCCS / FCS (cross-correlation, CC ary autocorrelation, AC) dia naneho fa ny fitambarana misy αS sy tau dia be dia be ao amin'ny santionany (jereo ny curve CC ao amin'ny sary 7b, tontonana havia), ary ny proteinina monomeric sisa tavela dia nipoitra toy ny a vokatry ny fizotran'ny dilution (jereo ny curve AC amin'ny sary 7b, tontonana havia).Ny fanandramana fanaraha-maso natao tamin'ny fepetra vahaolana mitovy amin'ny fampiasana santionany tsy misy afa-tsy proteinina monomeric dia tsy nahitana curve CC, ary ny AC curves dia mifanaraka tsara amin'ny modely diffusion singa iray (Eq. 4), izay misy ny proteinina monomeric manana ny coefficients diffusion andrasana (sary 7b). ), tontonana havanana).Latsaky ny 1 µm2/s ny fatran'ny diffusion an'ny singa mitambatra, ary ny an'ny proteinina monomeric dia eo amin'ny 1 µm2/s.50–100 µm/s;Ny soatoavina dia mitovy amin'ny soatoavina efa navoaka teo aloha ho an'ny sonicated αS amyloid fibrils sy monomeric αS misaraka amin'ny fepetra vahaolana mitovy44.Rehefa nandinika ny fitambarana tamin'ny famakafakana fipoahana TCCD izahay (sary 7c, tontonana ambony), dia hitanay fa ao amin'ny fitambarana mitoka-monina tsirairay (αS / Tau heteroaggregate), eo amin'ny 60% amin'ireo fitambarana hita dia misy αS sy tau, eo amin'ny 30% eo ho eo ihany no misy. tau, eo amin'ny 10% αS ihany.Ny fanadihadiana stoichiometric amin'ny αS / Tau heteroaggregates dia nampiseho fa ny ankamaroan'ny heteroaggregates dia nanankarena tao amin'ny tau (stoichiometry ambanin'ny 0.5, ny salan'isan'ny molekiola tau isaky ny aggregate dia 4 heny noho ny molekiola αS), izay mifanaraka amin'ny asantsika hita ao amin'ny FLIM in situ. andrana..Ny famakafakana FRET dia naneho fa ireo fitambarana ireo dia misy proteinina roa, na dia tsy dia misy dikany loatra aza ny sanda FRET tena izy amin'ity tranga ity, satria ny fizarana fluorophores amin'ny fitambarana tsirairay dia kisendrasendra noho ny tsy fahampian'ny proteinina tsy voatanisa ampiasaina amin'ny fanandramana.Mahaliana fa rehefa nanao famakafakana mitovy amin'ny fampiasana ny 45,46 matotra amyloid aggregation-deficient Tau variant (jereo ny Fig. 11a, b), dia nahatsikaritra fa na dia mitovy aza ny aggregation electrostatic αS (Fig. 11c, d). nihena be ny fahafahana mamorona aggregates ao anatin'ny coacervate ary hitan'ny FLIM ny toerana maromaro ao amin'ny andrana in-situ, ary ny curve-correlation malemy dia voamarika ho an'ny santionany mitokana.Na izany aza, ho an'ny fitambarana vitsivitsy hita (iray ampahafolon'ny Tau441 ihany), dia nahatsikaritra izahay fa ny fitambarana tsirairay dia nanankarena tao amin'ny αS noho ity variana Tau ity, miaraka amin'ny 50% eo ho eo amin'ireo fitambarana hita tsy misy afa-tsy molekiola αS, ary ny αS dia heterogène be loatra. .aggregates (jereo Fig. 11e fanampiny), mifanohitra amin'ny aggregates heterogène novokarin'ny Tau441 (sary 6f).Ny valin'ireo fanandramana ireo dia naneho fa na dia ny αS aza dia afaka miangona miaraka amin'ny tau ao anatin'ny coacervate, ny nucleation tau dia tsara kokoa amin'ireo fepetra ireo, ary ny aggregates toy ny amyloid dia afaka miasa toy ny endriky ny αS sy tau.Na izany aza, raha vao miforona ny fototry ny tau, ny fifandraisana heterotypic eo amin'ny αS sy ny tau dia ankasitrahana amin'ny fitambarana noho ny fifandraisana homotypic eo amin'ny molekiola tau;Hitantsika ihany koa ny tambajotra proteinina ao amin'ny coacervates αS / tau.
a Solontena fluorescence ara-nofo dian'ny molekiola tokana mitokana aggregates niforona ao amin'ny αS/Tau441 electrostatic coacervates.Ny fipoahana mifandraika amin'ny coaggregates αS / Tau441 (fipoahana eo ambonin'ny tokonam-baravarana voatondro) dia hita tamin'ny fantsona telo (AF488 sy Atto647N emission taorian'ny fientanentanana mivantana, tsipika manga sy mena, Atto647N taorian'ny fientanentanana ankolaka), FRET, tsipika violet).b Fanadihadiana FCS/FCCS momba ny santionan'ny aggregate αS/Tau441 mitoka-monina azo avy amin'ny LLPS (panneau havia).Ny curve autocorrelation (AC) ho an'ny AF488 sy Atto647N dia aseho amin'ny manga sy mena, ary ny curve cross-correlation (CC) mifandray amin'ny aggregate misy loko roa dia aseho amin'ny loko volomparasy.Ny curve AC dia maneho ny fisian'ny karazana proteinina monomeric sy aggregate misy marika, fa ny curve CC dia tsy mampiseho afa-tsy ny fiparitahan'ny aggregates misy marika roa.Ny famakafakana mitovy, fa eo ambanin'ny fepetra vahaolana mitovy amin'ny toerana mitoka-monina, ny santionany tsy misy afa-tsy monomeric αS sy Tau441 dia aseho ho fanaraha-maso eo amin'ny tontonana havanana.c Famakafakana tselatra fluorescence ny molekiola tokana amin'ny aggregate mitoka-monina miforona ao amin'ny coacervates electrostatic αS/Tau441.Ny fampahalalam-baovao ho an'ny fitambarana tsirairay hita amin'ny famerimberenana efatra samihafa (N = 152) dia natao hanohitra ny stoichiometry, ny soatoavin'ny S, ary ny fahombiazan'ny FRET (panneau ambony, ny lokon'ny loko dia maneho ny fisehoan-javatra).Karazana aggregate telo no azo avahana: -αS-ihany miaraka amin'ny S~1 sy FRET~0, Tau-ihany miaraka amin'ny S~0 sy FRET~1, ary heterogène Tau/αS aggregate miaraka amin'ny mpanelanelana S sy FRET Tombanana ny vola. Ny proteinina marika roa hita ao amin'ny fitambarana heterogène tsirairay (N = 100) dia aseho eo amin'ny tontonana ambany (ny haben'ny loko dia maneho ny fisehoan-javatra).Ny angona manta dia omena amin'ny endrika rakitra data manta.
Ny fahamatorana na ny fahanteran'ny proteinina ranoka dia mivadika ho rafitra toy ny gel na mafy rehefa mandeha ny fotoana dia voalaza fa tafiditra amin'ny fiasa ara-batana maromaro amin'ny condensate47 ary koa amin'ny aretina, ho toy ny dingana tsy ara-dalàna mialoha ny fanangonana amyloid 7, 48, 49. Eto mianatra amin'ny antsipiriany ny fisarahana sy ny fitondran-tena.LSPT αS eo anatrehan'ny polycations kisendrasendra ao amin'ny tontolo voafehy amin'ny ambany micromolar concentrations sy ny physiologically toe-javatra mifandraika (mariho fa ny kajy ara-physiologique concentration of αS dia> 1 µM50), manaraka ny mahazatra thermodynamika fitondran-tena ny LPS.Hitanay fa ny αS, izay misy faritra C-terminal be fiampangana be dia be amin'ny pH ara-batana, dia afaka mamorona vongan-dranomandry manankarena proteinina amin'ny vahaolana aqueous amin'ny alàlan'ny LLPS eo anatrehan'ny peptides mikorontana be cationic toy ny pLK na Tau amin'ny alàlan'ny dingan'ny electrostatic. sarotra condensation eo anatrehan'ny aggregation macromolecules.Ity dingana ity dia mety hisy fiantraikany mifandraika amin'ny tontolon'ny sela izay ihaonan'ny αS ny molekiolan'ny polycationic isan-karazany mifandray amin'ny fitambaran'ny aretina na in vitro sy in vivo51,52,53,54.
Amin'ny fandalinana maro, ny dinamika proteinina ao anatin'ny vongan-drano dia noheverina ho iray amin'ireo antony lehibe mamaritra ny fizotran'ny fahamatorana55,56.Ao amin'ny electrostatic αS coacervates amin'ny polycations, ny fizotran'ny fahamatorana dia toa miankina amin'ny tanjaky ny fifandraisana amin'ny polycations, ny valence ary ny hamaroan'ireo fifandraisana ireo.Ny teoria equilibrium dia manolo-kevitra fa ny tontolon'ny equilibrium amin'ny fanjakana ranon-javatra roa dia ny fisian'ny vongan-drano be misy biopolymers izay mitondra LLPS57,58.Ny fitomboan'ny droplet dia azo atao amin'ny alàlan'ny Ostwald maturation59, coalescence60 na fanjifana monomer maimaim-poana amin'ny dingana miparitaka61.Ho an'ny αS sy Tau441, ΔNt-Tau na pLK, ny ankamaroan'ny proteinina dia nifantoka tamin'ny condensate eo ambanin'ny fepetra ampiasaina amin'ity fianarana ity.Na izany aza, raha nitambatra haingana ny vongan-dranon'ny tau feno, dia sarotra ho an'ny ΔNt-Tau sy pLK ny fivondronan'ny ranomandry sy ny fandotoana, izay nanoro ny fahaverezan'ny fananana ranon-javatra haingana ao amin'ireo rafitra roa ireo.Araka ny fanadihadiana nataonay FLIM-FRET, ny pLK sy ny ΔNt-Tau droplets efa antitra dia nampiseho ambaratonga mitovy amin'ny fitambaran'ny proteinina (fiainan'ny fluorescence mitovy) amin'ny ranon-tsavony tany am-boalohany, izay nanoro hevitra fa ny tambajotra proteinina tany am-boalohany dia voatazona, na dia henjana kokoa aza.
Manamarina ny vokatra andrana izahay amin'ity modely manaraka ity (sary 8).Ny vongan-drano miforona vonjimaika tany am-boalohany dia matetika tambajotra proteinina tsy misy fanonerana elektrostatika, ary noho izany dia misy ny tsy fifandanjan'ny fiampangana, indrindra eo amin'ny fifandraisan'ny vongan-drano, ka miteraka vongan-drano misy taratra avo lenta.Mba hanonerana ny fiampangana (fisehoan-javatra iray antsoina matetika hoe fihenan'ny valence) sy hanamaivanana ny mety ho etỳ ambonin'ny vongan-drano, ny vongan-drano dia afaka mampiditra polypeptides vaovao avy amin'ny dilute, mandamina indray ny tambajotra proteinina mba hanamafisana ny fifandraisan'ny charge-charge, ary hifaneraserana amin'ny vongan-drano hafa.miaraka amin'ny surfaces (wetting).Ny ranon-tsavony αS / pLK, noho ny tambajotra proteinina tsotra kokoa (fifandraisana heterotypic fotsiny eo amin'ny αS sy pLK) ary ny fifandraisana bebe kokoa amin'ny fifandraisana proteinina-proteinina, dia toa afaka mampifandanja haingana kokoa ny fiampangan'ny condensate;Eny tokoa, nahita kinetika proteinina haingana kokoa izahay tamin'ny coacervates αS / pLK tamin'ny voalohany noho ny αS / Tau.Aorian'ny fihenan'ny valence dia lasa kely kokoa ny fifaneraserana ary very ny fananany ranon-javatra ireo vongan-drano ary mivadika ho vongan-jiro tsy mirehitra toy ny gel izay misy poizina ambany elektrôstatika ambany (ka tsy afaka mandona ny tany).Mifanohitra amin'izany kosa, tsy dia mahomby loatra amin'ny fanatsarana ny fifandanjan'ny fiampangan'ny vongan-drano ny αS/Tau noho ny tambajotra proteinina sarotra kokoa (miaraka amin'ny fifaneraserana homotypic sy heterotypic) ary ny toetra malemy kokoa amin'ny fifandraisana proteinina.Izany dia miteraka vongan-drano izay mitazona fihetsika mivaingana mandritra ny fotoana maharitra ary mampiseho ny tanjaky ny elektrôstatika avo lenta izay mazàna ahena amin'ny alàlan'ny fampifangaroana sy ny fitomboana (noho izany ny fampihenana ny haavon'ny faritra / ny habetsahan'ny ranon-tsavony) ary amin'ny alàlan'ny fandotoana ny simika hydrophilic surface.Izany dia mamorona tranomboky proteinina lehibe mivondrona izay mitazona fananana ranoka satria mijanona ho mandalo be ny fifandraisana noho ny fikarohana tsy tapaka momba ny fanatsarana ny fiampangana ao amin'ny tambajotra proteinina.Mahaliana fa ny endrika N-tapahina amin'ny farany amin'ny Tau, anisan'izany ny isoforme62 voajanahary voajanahary, dia mampiseho fitondran-tena manelanelana, miaraka amin'ny coacervates ny fahanterana miaraka amin'ny αS ho lasa vongan-tsavony toy ny gel, ny hafa kosa miova ho condensate ranon-javatra lehibe.Ity duality amin'ny fahamatorana ny αS electrostatic coacervates dia mifanaraka amin'ny LLPS teorika sy fanandramana fanandramana vao haingana izay nahita ny fifandraisana misy eo amin'ny valence depletion sy ny electrostatic sieving ao amin'ny condensates ho fanalahidin'ny fanaraha-maso ny condensate habe sy ny fluide fananana.Mekanisma 58.61.
Ity tetika ity dia mampiseho ny lalan'ny aggregation amyloid ho an'ny αS sy Tau441 amin'ny LLPS sy LSPT.Miaraka amin'ny faritra manankarena anion (mena) sy manankarena kation (manga) fanampiny, ny coacervates electrostatic αS sy tau miaraka amin'ny valence mahafa-po dia manana angovo ambany kokoa ary noho izany dia mihena ny coalescence, ka miteraka fahanterana haingana.Ny toetry ny gel tsy misy agglomerated dia tratra..Ity toe-javatra ity dia tena tsara amin'ny trangan'ny rafitra αS / pLK noho ny fifandraisana ambony kokoa sy ny tambajotram-pifandraisan'ny proteinina tsotra kokoa, izay mamela ny fifindrana haingana toy ny gel.Mifanohitra amin'izany, ny vongan-dranomamy misy valence tsy mahafa-po ary, noho izany, ny faritra misy proteinina azo ampiasaina amin'ny fifandraisana, dia manamora ny fikorianan'ny coacervate sy ny fandosana ny habakabaka hydrophilika mba hampihenana ny angovo avo lenta.Ity toe-javatra ity dia tsara kokoa ho an'ny coacervates αS/Tau441, izay manana tambajotra sarotra multivalent ahitana fifandraisana malemy Tau-Tau sy αS-Tau.Ho setrin'izany, ny coacervates lehibe kokoa dia hihazona mora kokoa ny toetrany toy ny ranoka, mamela ny fifandraisana proteinina amin'ny proteinina hafa hitranga.Amin'ny farany, ny fitambarana heterogène amyloid misy αS sy tau dia miforona ao anatin'ny fluid coacervate, izay mety misy ifandraisany amin'ireo hita ao amin'ny vatana fampidirana, izay famantarana ny aretina neurodegenerative.
Ny rafitra lehibe toy ny ranon-javatra niforona nandritra ny fahamatoran'ny αS / Tau441 miaraka amin'ny tontolo iainana proteinina tena mihetsiketsika nefa mavitrika ary, amin'ny lafiny kely kokoa, ny αS / ΔNt-Tau coacervates dia fitahirizana tsara indrindra ho an'ny fananganana proteinina.Hitanay tokoa ny fiforonan'ny fitambaran'ny proteinina mafy amin'ity karazana coacervates proteinina ity, izay matetika misy αS sy tau.Nasehonay fa ireo heteroaggregates ireo dia miorina amin'ny fifandraisana tsy electrostatic, afaka mamatotra ny loko ThT manokana amin'ny amyloid amin'ny fomba mitovy amin'ny fibrils amyloid mahazatra, ary manana fanoherana mitovy amin'ny fitaomana isan-karazany.Ny aggregates αS / tau noforonin'ny LLPS dia naseho fa manana fananana toy ny amyloid.Raha ny marina, ny variana matotra amin'ny Tau tsy ampy amin'ny fivondronan'ny amyloid dia tena simba amin'ny fananganana ireo aggregates αS heterogène ireo ao anatin'ny coacervate electrostatic liquid.Ny fiforonan'ny αS/Tau441 aggregates dia tsy hita afa-tsy tao anatin'ny coacervates, izay nitazona fananana toy ny ranon-javatra, ary na oviana na oviana, raha tsy tonga any amin'ny fanjakana gel ny coacervates / droplets.Amin'ity tranga farany ity, ny fitomboan'ny tanjaky ny fifandraisana electrostatic ary, vokatr'izany, ny henjana amin'ny tambajotra proteinina dia manakana ny fanovana ilaina amin'ny proteinina mba hametrahana fifandraisana proteinina vaovao ilaina amin'ny nucleation amyloid.Na izany aza, izany dia azo tanterahina amin'ny coacervates malefaka kokoa, toy ny ranon-javatra, izay mety hijanona ho rano kokoa rehefa mitombo ny habeny.
Ny zava-misy fa ny fiforonan'ny aggregates ao anatin'ny dingana condensate dia tsara kokoa amin'ny condensate αS / Tau lehibe noho ny amin'ny vongan-drano kely izay haingana gel, dia manasongadina ny maha-zava-dehibe ny famantarana ny lafin-javatra izay mifehy ny coalescence droplet.Noho izany, tsy vitan'ny hoe misy fironana amin'ny fisarahana amin'ny dingana, fa ny haben'ny condensate dia tsy maintsy fehezina amin'ny fampandehanana tsara sy ny fisorohana ny aretina58,61.Ny vokatray koa dia manasongadina ny maha-zava-dehibe ny fifandanjana eo amin'ny LLPS sy LSPT ho an'ny rafitra αS / Tau.Na dia mety hiaro amin'ny fivondronan'ny amyloid aza ny fananganana vongan-dranomandry amin'ny alàlan'ny fampihenana ny habetsahan'ny monomera proteinina azo alaina ao anatin'ny fepetra saturation, araka ny natolotra tamin'ny rafitra hafa63,64, ny fifangaroan'ny droplet amin'ny haavon'ny droplet avo dia mety hitarika amin'ny fanangonana proteinina anatiny amin'ny alàlan'ny fanavaozana miadana.tambajotra proteinina..
Amin'ny ankapobeny, ny angon-drakitray dia manantitrantitra mafy ny maha-zava-dehibe ny valence mitambatra sy ny fifandraisana mahafa-po / tsy mahafa-po amin'ny tamba-jotra amin'ny tontolon'ny LSPT.Amin'ny ankapobeny, asehontsika fa ny condensate αS / Tau441 feno lava dia afaka mitambatra tsara sy miorim-paka mba hamorona heteroaggregate mitovy amin'ny amyloid izay misy proteinina roa ary manolotra mekanika molekiola mifototra amin'ny valin'ny fanandramana.Ny fitambaran'ny proteinina roa ao amin'ny fluid coacervate αS / Tau izay taterinay eto dia mety misy ifandraisany amin'ny fiaraha-miombon'antoka proteinina roa ao anaty fampidirana, izay mariky ny aretina, ary mety hanampy amin'ny fahatakarana ny fifandraisana misy eo amin'ny LLPS sy ny LLPS. amyloid aggregation, manokatra ny lalana ho an'ny IDP be fiampangana amin'ny neurodegeneration.
Monomeric WT-αS, cysteine ​​​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) ary ΔCt-αS variants (Δ101-140) dia naseho tao amin'ny E. coli ary nodiovina araka ny voalaza teo aloha.5 mM DTT dia nampidirina tamin'ny dingana rehetra amin'ny fanadiovana ny αS cysteine ​​​​mutants mba hisorohana ny fananganana fifamatorana disulfide.Tau441 isoform (plasmid azo avy amin'ny Addgene #16316), ΔNt-Tau variant (Δ1-150, azo avy amin'ny cloning IVA miaraka amin'ny primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ary AggDef-Tau variant miaraka amin'ny kolontsaina 3GCTC5-Tau (1ΔTC275). Nitombo ho OD600 = 0.6-0.7 amin'ny 37 ° C sy 180 rpm, ary ny fanehoana dia nampidirina tamin'ny IPTG nandritra ny 3 ora tamin'ny 37 ° C.Manangona sela amin'ny 11,500 xg mandritra ny 15 minitra amin'ny 4 ° C ary sasao amin'ny saline buffer misy 150 mM NaCl.Avereno ny pellet amin'ny buffer lysis (20 ml isaky ny 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100).Ny dingana sonication dia natao tamin'ny gilasy miaraka amin'ny amplitude 80% ho an'ny 10 pulses (1 min on, 1 min off).Aza mihoatra ny 60 ml amin'ny ultrasound iray.Ny E. coli lysates dia nafanaina tamin'ny 95 ° C. nandritra ny 20 minitra, avy eo nangatsiaka tamin'ny ranomandry ary natao centrifuge tamin'ny 127.000 × g nandritra ny 40 minitra.Ny supernatant nohazavaina dia nampiharina tamin'ny membrane 3.5 kDa (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) ary nalaina tamin'ny 4 L ny dialyse buffer (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2mM , PMSF 0,1 mM) mandritra ny 10 ora.Ny tsanganana fifanakalozana cation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, Etazonia) dia nampitoviana tamin'ny buffer equilibration (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Ny tau lysate dia voasivana tamin'ny alàlan'ny sivana PVDF 0.22 μm ary nampidirina tao amin'ny tsanganana tamin'ny taham-pidirana 1 ml / min.Ny elution dia natao tsikelikely, tau dia nesorina tamin'ny 15-30% elution buffer (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Ny ampahany dia nodinihina tamin'ny SDS-PAGE, ary ny ampahany misy tarika iray miaraka amin'ny lanjan'ny molekiola andrasana amin'ny tau dia nifantoka tamin'ny fampiasana sivana centrifuge 10 kDa ary nosoloina buffer misy 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ary DTT 2 mM ho an'ny. ny fifantohana proteinina farany dia 100 μM.Ny vahaolana proteinina avy eo dia nandalo tamin'ny sivana PVDF 0,22 μm, nangatsiaka haingana ary tehirizina tao amin'ny -80 ° C.Ny Proteinina K18 dia nomen'ny Pr Alberto Boffi.Ny fahadiovan'ny fanomanana dia > 95% araka ny nohamafisin'ny SDS-PAGE sy MALDI-TOF/TOF.Ny cysteinees isan-karazany dia nasiana marika simika miaraka amin'ny AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Etazonia) na TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).dia nohamafisin'ny absorbance sy MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ary K18 dia voamarika miaraka amin'ny sisa tavela amin'ny cystine amin'ny toerana 191 sy 322 mampiasa Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Alemana) manaraka ny fomba fiasa mitovy.Ny sandan'ny net isaky ny sarintany sisa tavela ho an'ny αS sy Tau441 dia novokarina tamin'ny fampiasana CIDER66.
Solid poly-L-lysine (pLK DP 90-110 araka ny NMR avy amin'ny mpamatsy, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, Etazonia) dia levona tao amin'ny 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 hatramin'ny 10 mM fifantohana, dingana sonicated ho an'ny 5 minitra ao anaty rano fandroana ultrasonic ary tehirizo amin'ny -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, Etazonia) ary FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, Etazonia) dia azo levona amin'ny rano ary miparitaka be amin'ny buffer LLPS.Ny dialyse dia manala ny sira maloto.Avy eo izy ireo dia voasivana amin'ny alàlan'ny sivana syringe misy habe 0.22 μm, ary nokajiana tamin'ny fampiasana refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, Etazonia).Ny santionan'ny LLPS dia nomanina tamin'ny mari-pana ao amin'ny efitrano manaraka: ny buffer sy ny extrusion dia nifangaro ary 1 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2- (Ethane- 1, 2-diyldinitrile) asidra tetraacetic (EDTA, carboxynth) ary fifangaroan'ny protease inhibitor 1% (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Avy eo dia ampiana αS sy polycations fused (safidy pLK na Tau).Ho an'ny andrana andiam-potoana thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), ampiasao ny totalin'ny ThT ho antsasaka ny fifantohana αS.Afangaro moramora nefa tsara ny santionany mba hahazoana antoka fa homogene izy ireo.Ny fifantohana amin'ny singa tsirairay dia miovaova amin'ny fanandramana mankany amin'ny fanandramana, araka ny voalaza ao amin'ny fizarana Vokatra.Azide dia nampiasaina tamin'ny fifantohana 0,02% (w / v) isaky ny mihoatra ny 4 ora ny faharetan'ny fanandramana.Ho an'ny famakafakana rehetra mampiasa santionany LLPS, avelao ny fangaro hampitony mandritra ny 5 minitra alohan'ny hanaovana fanadihadiana.Ho an'ny famakafakana ny fanaparitahana maivana, 150 µl ny santionany dia napetaka tamin'ny microplates 96-well tsy mifatotra (µClear®, mainty, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Aotrisy) ary norakofana sarimihetsika adhesive.Ny LLPs dia nanara-maso tamin'ny fandrefesana ny absorbance amin'ny 350 nm eo afovoan'ny vahaolana amin'ny mpamaky takelaka CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemana).Ny andrana dia natao tamin'ny triplicate tamin'ny 25 ° C, ary ny lesoka dia nokajiana ho toy ny fivilian-dàlana mahazatra amin'ny salan'isa.Ny dingana dilute dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny centrifugation santionany sy ny fanadihadiana gel SDS-PAGE, ary ny ampahany αS ao amin'ny dilute sy concentré dia nofaritana tamin'ny vahaolana LLPS isan-karazany.Ny santionany LLPS 100 μl misy 1 μM AF488-labeled αS dia nomanina tamin'ny fampifangaroana tsara arahin'ny centrifugation amin'ny 9600 × g mandritra ny 30 minitra, ary avy eo dia hita matetika ny entona.Ny 50 μl ambony amin'ny supernatant dia nampiasaina ho an'ny fampitomboana proteinina amin'ny fampiasana gel SDS-PAGE.Ny gel dia nojerena tamin'ny sivana AF488 tamin'ny alàlan'ny rafitra imaging gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Etazonia) na nolokoina tamin'ny tasy Coomassie ary naseho tamin'ny sivana mety.Ny tarika vokatr'izany dia nodinihina tamin'ny fampiasana ImageJ version 1.53i (National Institutes of Health, Etazonia).Ny andrana dia natao tamin'ny dika mitovy amin'ny andrana roa samy hafa miaraka amin'ny vokatra mitovy.
Amin'ny ankapobeny, 150 μl ny santionany dia ampiharina amin'ny microplates 96-well tsy mifamatotra ary aseho amin'ny mari-pana amin'ny efitrano amin'ny microscope inverted Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).Ho an'ny fanandramana amin'ny toerana dia nampiasaina ihany koa ny takelaka µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) na microplates polystyrene 96-well (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).EL6000 halogen na merkuri metal halide jiro dia nampiasaina ho loharanon-jiro (ho an'ny BF/DIC sy WF imaging, tsirairay avy).Ho an'ny microscopy WF, ny tanjon'ny rivotra 40x (Leica Microsystems, Alemaina) dia nampiasaina mba hampifantoka ny hazavana amin'ny santionany sy hanangonana azy.Ho an'ny santionany misy marika AF488 sy ThT, sivana fientanam-po sy famotsorana miaraka amin'ny seta sivana GFP mahazatra, sivana bandpass excitation sy emission, tsirairay avy, sivana bandpass 460–500 nm sy 512–542 nm, ary fitaratra dichroic 495 nm.Ho an'ny santionany misy soratra miaraka amin'ny Atto647N, dia misy sivana Cy5 mahazatra miaraka amin'ny sivana 628-40 nm sy 692-40 nm, ary fitaratra dichroic 660 nm.Ho an'ny mikroskopika BF sy DIC, ampiasao ny tanjona fanangonana hazavana hita taratra mitovy.Noraketina tamin'ny fakan-tsary CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Alemaina) ny hazavana nangonina.Ny fotoana fampitana dia 50 ms ho an'ny BF sy DIC microscopy imaging ary 20-100 ms ho an'ny WF microscopy imaging.Raha ampitahaina dia 100 ms ny fotoana fampitandremana ho an'ny fanandramana rehetra miaraka amin'ny ThT.Natao ny andrana ara-potoana mba hijerena ny firaisan'ny vongan-drano, miaraka amin'ny sary angonina isaky ny 100 ms mandritra ny minitra maromaro.ImageJ (NIH, Etazonia) dia nampiasaina tamin'ny famakafakana sary.Ny andrana dia natao tamin'ny in-telo misy valiny mitovy.
Ho an'ny fanandramana colocalization, fanamboarana FRAP sy 3D, ny sary dia azo tamin'ny mikraoskaopy confocal inverted Zeiss LSM 880 tamin'ny alàlan'ny fanontana manga ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemaina).Ny santionany amin'ny 50 µl dia nampiharina tamin'ny lovia µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Alemaina), nokarakaraina tamin'ny polymère hydrophilic (ibiTreat) ary napetraka tao amin'ny tanjona fandrotsahana menaka 63 × (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil) amin'ny DIC).Ny sary dia azo tamin'ny alàlan'ny 458 nm, 488 nm, ary 633 nm argon laser tsipika miaraka amin'ny famaha ny 0.26 µm / pixel ary ny fotoana fiposahan'ny 8 µs / pixel ho an'ny fientanam-po sy ny famoahana ny varavarankely amin'ny 470-600 nm, 493-628 nm, ary 638–755 nm dia nampiasaina mba hijerena ThT, AF488 ary Atto647N, tsirairay avy.Ho an'ny fanandramana FRAP, ny sarin'ny santionany tsirairay dia voarakitra amin'ny frame 1 isan-tsegondra.Ny fanandramana dia natao tamin'ny triplicate amin'ny mari-pana amin'ny efitrano misy valiny mitovy.Ny sary rehetra dia nodinihina tamin'ny fampiasana rindrambaiko fanontana manga Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemaina).Ny curve FRAP dia natao ara-dalàna, novolavolaina ary nampifandraisina tamin'ny angon-drakitra henjana / fotoana nalaina tamin'ny sary mampiasa Zen 2 mampiasa OriginPro 9.1.Ny curves fanarenana dia napetraka amin'ny maodely mono-exponential mba hitazomana ny fiparitahan'ny molekiola miaraka amin'ny fe-potoana exponential fanampiny ho an'ny vokatra fanalefahana ny fahazoana.Avy eo dia nanao kajy D izahay tamin'ny fampiasana ny radius bleaching nominal sy ny antsasaky ny fiainana efa voafaritra teo aloha toy ny ao amin'ny equation of Kang et al.5 35 aseho.
Ny variana cysteine ​​tokana an'ny αS dia natambatra tamin'ny 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) amin'ny toerana 24 (TEMPOL-24-αS) sy 122 (TEMPOL-122-αS), tsirairay avy.Spin Labeling Ho an'ny fanandramana EPR, ny fifantohana αS dia napetraka amin'ny 100 μM ary ny fifantohana PEG dia 15% (w / v).Ho an'ny fepetra fanangonana isan-karazany, ny tahan'ny αS: pLK dia 1:10, raha ny tahan'ny αS: ΔNt-Tau sy αS: Tau441 kosa dia voatazona amin'ny 1: 1.Ho an'ny fanandramana titration mamatotra amin'ny tsy fisian'ny vahoaka, ny TEMPOL-122-αS dia notazonina tamin'ny 50 μM ary ny polycations dia nalaina tamin'ny fitomboan'ny fifantohana, nanomana ny fepetra tsirairay.Ny fandrefesana CW-EPR dia natao tamin'ny alàlan'ny spectrometer Bruker ELEXSYS E580 X-band miaraka amin'ny resonator Bruker ER4118 SPT-N1 miasa amin'ny onjam-peo mikraoba (SHF) amin'ny ~ 9.7 GHz.Ny mari-pana dia napetraka amin'ny 25 ° C ary fehezin'ny cryostat azota azota.Ny spectra dia azo tamin'ny toe-javatra tsy feno amin'ny herin'ny MW 4 mW, amplitude modulation 0.1 mT, ary matetika 100 kHz.Ny hamafin'ny spectral dia natao ara-dalàna mba hisorohana ny tsy fitovian'ny fifantohana amin'ny fihodinana eo amin'ny santionany sy ny mety ho fihenan'ny fihodinana noho ny fifantohana sisa tavela amin'ny santionany misy Tau441 na ΔNt-Tau (misy ao amin'ny vahaolana proteinina tany am-boalohany).Ny sanda nomena ny g dia azo vokatry ny EPR spectral modeling natao tamin'ny fampiasana ny Easyspin software (v. 6.0.0-dev.34) nampiharina ao amin'ny Matlab®67.Modely isotropic singa iray/roa no nampiasaina mba hamolavolana ny angona.Taorian'ny fampandehanana ara-dalàna ny famantarana rehetra, dia nokajiana ny sisa tavela tamin'ny fanesorana ny simulation tsirairay avy amin'ny spektrika andrana mifanaraka amin'izany.Ho an'ny famakafakana titration mamatotra, dia nampiasaina ny hamafin'ny tarika fahatelo amin'ny tarika faharoa amin'ny spectrum EPR mahazatra (IIII / III) mba hanaraha-maso ny fatoran'ny polycations amin'ny αS.Mba hanombantombanana ny tsy miova disociation (Kd), ny curve vokatr'izany dia napetraka amin'ny modely eo ho eo amin'ny fiheverana n toerana mamatotra mitovy sy mahaleo tena.
Ny fanandramana spectroscopy NMR dia natao tamin'ny alàlan'ny Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spectrometer misy cryoprobe sy Z-gradient.Ny fanandramana rehetra dia natao tamin'ny fampiasana 130-207 µM αS ary mifanaraka amin'ny αS / ΔNt-Tau sy pLK mitovy amin'ny 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ary natao tamin'ny 15 ° C.Mba hanaraha-maso ny LPS amin'ny NMR, 10% PEG dia nampiana ireo santionany efa mifangaro.Ny tetik'asa fikorontanan'ny simika (sary 1b) dia mampiseho ny fiovan'ny simika 1H sy 15N eo ho eo.Ny spectra αS 2D1H-15N HSQC dia nomena mifototra amin'ny andraikitra teo aloha (BMRB entry #25227) ary nohamafisina tamin'ny alàlan'ny firaketana sy famakafakana ny spectra 3D an'ny HNCA, HNCO ary CBCAcoNH.Ny fiovan'ny simika 13Cα sy 13Cβ dia nokajiana teo anatrehan'ny ΔNt-Tau na pLK mba handrefesana ny fiovana mety hitranga amin'ny fironana ara-drafitra faharoa raha oharina amin'ny fiovan'ny simika αS amin'ny conformation coil 68 (sary fanampiny 5c).Ny tahan'ny R1ρ dia norefesina tamin'ny alàlan'ny firaketana ny fanandramana hsqctretf3gpsi (azo avy amin'ny tranomboky Bruker) miaraka amin'ny fahatarana 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ary 800 ms, ary ny fiasa exponential dia namboarina tamin'ny fahatarana mahery vaika. fotoana hamaritana ny R1ρ sy ny tsy fahatokisana andrana.
Ny fanandramana mikroskopika fluorescence roa-loko roa dia natao tamin'ny mikraoskaopy confocal fluorescence MT200 vita ara-barotra (PicoQuant, Berlin, Alemaina) miaraka amin'ny fitaovana fanisana fotony tokana (TCSPC) mifandraika amin'ny fotoana.Ny lohan'ny diode laser dia ampiasaina amin'ny fientanentanana interleaved (PIE), ny taratra dia mandalo amin'ny onjam-peo tokana ary alefa amin'ny herin'ny laser 10 ka hatramin'ny 100 nW ho an'ny tsipika laser 481 nm sy 637 nm norefesina taorian'ny fitaratra dichroic.Izany dia miantoka ny tahan'ny fanisam-pototra tsara indrindra, misoroka ny fiantraikan'ny foton'ny aliasing, photobleaching ary saturation.μ-Slide angiogenesis coverlips na takelaka (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) dia napetraka mivantana tao anaty rano asitrika eo ambonin'ny lens Super Apochromat 60x NA 1.2 misy vozon'akanjo fanitsiana (Olympus Life Sciences, Waltham, Etazonia).Ny fitaratra dichroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) dia nampiasaina ho toy ny mpizara beam lehibe.Ny taratra tsy mifantoka dia voasakana amin'ny lavaka misy savaivony 50 microns, avy eo ny taratra mifantoka dia zaraina amin'ny làlam-pandrenesana 2 amin'ny alàlan'ny 50/50 beam splitter.Ny sivana emission bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 ho an'ny loko maitso (AF488) ary 690/70 ho an'ny loko mena (Atto647N) dia nampiasaina teo anoloan'ny mpitsikilo.Single-photon avalanche diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia) dia nampiasaina ho mpitsikilo.Samy natao tamin'ny fampiasana ny rindrambaiko SymphoTime64 azo amidy (PicoQuant GmbH, Berlin, Alemaina) ny fanangonana angon-drakitra sy ny famakafakana.
Dimampolo microliter ny santionany LLPS no ampiharina amin'ny μ-Slide angiogenesis lavadrano (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemaina).Ny sary vokarina dia mifantoka amin'ny 20 µm ambonin'ny lavaka fantsakana ho an'ny halaviran'ny asa tanjona tsara indrindra ho an'ny vongan-drano mihantona ary hatramin'ny ~1 µm ho an'ny rafts sy teboka misy famaha axial farafahakeliny 0.25 µm/pixel ary fotoana fahatarana 400 µs/pixel.Safidio ny angon-drakitra amin'ny alalan'ny fampiharana ny tokonam-baravarankely mifototra amin'ny salan'isan'ny mari-pamantarana fototra (PBG, midika + 2σ) ho an'ny fantsona tsirairay ka ny vongan-dranon'ny proteinina, ny raft, na ny tasy ihany no voafantina, manivana izay mety ho fiaviana avy amin'ny dingana miparitaka.Mba handinihana ny androm-piainan'ny karazam-biby tsirairay (τ) isaky ny fantsona (maitso, "g" ho an'ny AF488 sy mena, "r" ho an'ny Atto647N), dia nisafidy faritra mahaliana (ROI) misy vongan-drano, rafts, na pentina izahay (sary fanampiny 1). ).8b) ary nahazo azy ireo tamin'ny alàlan'ny fametahana ny fahalovana mandritra ny androm-piainany (τD, τR ary τP ho an'ny vongan-drano, rafts na tasy, tsirairay avy, jereo ny Fig. 8c fanampiny) amin'ny fantsona tsirairay amin'ny alàlan'ny famakafakana mifanaraka amin'ny rambony sy modely fandotoana singa roa.Salan'isa τ avy amin'ny τ .Ny ROI izay namokatra fotona vitsy loatra ho an'ny fitongilanana marobe dia nesorina tamin'ny fanadihadiana.Ny fanapahana nampiasaina dia <104 photons ho an'ny rafts sy teboka ary 103 ho an'ny drops.Manana tokonam-baravarana ambany kokoa ny vongan-drano satria sarotra ny mahazo ny fiolahana simba miaraka amin'ny soatoavina mahery vaika kokoa, satria matetika no kely kokoa sy tsy dia betsaka ny vongan-tsavony eo amin'ny sehatry ny sary.Ny ROI misy fanisana fotona mihoatra ny fetran'ny fanangonana foton (apetraka amin'ny >500 isa/pixel) dia nesorina ihany koa hanaovana fanadihadiana.Ampifanaraho amin'ny 90% amin'ny fara-tampony ny curve fahapotehana mahery vaika azo avy amin'ny faritra liana amin'ny hamafin'ny 90% amin'ny fara-tampony (manaraka kely ny hamafin'ny fahalovana) hatramin'ny fiandohan'ny androm-panompoana mba hiantohana ny fitsabahan'ny IRF faran'izay kely nefa mitazona izany ho an'ny fahasimbana rehetra. Settings Relative time window Nohadihadiana 25 ka hatramin'ny 50 ROI ho an'ny rafts sy spots ary 15-25 ROI ho an'ny drops, sary voafantina avy amin'ny replika mihoatra ny 4 voarakitra avy amin'ny fanandramana tsy miankina 3 farafahakeliny.Ny t-test misy rambo roa dia nampiasaina hanombanana ny fahasamihafan'ny statistika eo amin'ny karazana na eo amin'ny rafitra coacervate.Ho an'ny famakafakana pixel-by-pixel amin'ny androm-piainana (τ), ny totalin'ny fihenan'ny androm-piainana eo amin'ny saha ho an'ny fantsona tsirairay dia nokajiana ary natao ny tombantombana amin'ny maodely attenuation exponential singa 2/3.Ny fampihenana ny androm-piainany ho an'ny piksel tsirairay avy eo dia napetraka tamin'ny fampiasana ny sanda τ voaisa teo aloha, ka nahatonga sary pseudocolor FLIM fit.Ny halavan'ny androm-piainan'ny rambony dia mitovy amin'ny sary rehetra amin'ny fantsona iray ihany, ary ny fahalòvana tsirairay dia namokatra fotona ampy mba hanomezana fahafaham-po azo antoka.Ho an'ny famakafakana FRET, ny piksel dia nofantenana tamin'ny alàlan'ny fampiharana ny fetra ambany kokoa amin'ny foton'ny 100, izay manana salan'isa famantarana background (FBG) amin'ny sary 11.Ny hamafin'ny fluorescence amin'ny fantsona tsirairay dia nahitsy tamin'ny alàlan'ny fanitsiana natao tamin'ny fanandramana: 69 spectral crosstalk α dia 0.004, β mivantana mivantana dia 0.0305, ny fahombiazan'ny detection γ dia 0.517.Ny fahombiazan'ny FRET amin'ny haavon'ny piksel dia kajy amin'ny fampiasana ity equation manaraka ity:
izay ny FDD dia ny hamafin'ny fluorescence hita ao amin'ny fantsona mpamatsy (maitso), ny FDA dia ny hamafin'ny fluorescence hita ao amin'ny fantsona acceptor (mena) eo ambanin'ny fientanentanana ankolaka, ary ny FAA dia ny hamafin'ny fluorescence hita ao amin'ny fantsona acceptor (mena) eo ambany fientanam-po mivantana ( PIE).Ny fiposahan'ny fluorescence dia hita ao amin'ny fantsona).
Apetraho 100 µl ny vahaolana fanehoan-kevitra LLPS misy 25 µM monomeric Tau441 tsy misy marika (miaraka na tsy misy 25 µM αS) ao amin'ny buffer LLPS (ampiana toy ny etsy ambony) amin'ny microplate 96-well tsy mifatotra miaraka amin'ny adhesive foil coating sy ny fananganana droplet dia nozahana tamin'ny WF micros. fampitoviana.ao anatin'ny 10 min.Taorian'ny 48 ora incubation amin'ny mari-pana amin'ny efitrano, dia voamarina ny fisian'ny rafts proteinina sy ny tasy.Esory amim-pitandremana ny ranon-javatra eo ambonin'ny rafts avy amin'ny fantsakana, ary ampio 50 L de dissociation buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ary atsofohy mandritra ny 10 min.Ny fatran'ny sira avo lenta dia miantoka fa tsy hiverina ny LLPS noho ny PEG sisa, ary ny fivorian'ny proteinina mety ho voaforona amin'ny fifandraisana electrostatic ihany dia ho rava.Avy eo dia nesorina tsara tamin'ny tendron'ny micropipette ny fanambanin'ny lavaka fantsakana ary nafindra tany amin'ny lavaka fantsakana tsy misy na inona na inona ny vahaolana azo.Taorian'ny fampidirana ireo santionany tamin'ny 50 μM ThT nandritra ny 1 ora, dia nojerena tamin'ny mikroskopika WF ny fisian'ny toerana mitoka-monina.Omano ny fibrils sonicated αS amin'ny fampidirana 300 µl amin'ny vahaolana 70-µM αS ao amin'ny PBS amin'ny pH 7.4, ny sodium azide 0.01% amin'ny 37 ° C ary 200 rpm amin'ny shaker orbital mandritra ny 7 andro.Ny vahaolana dia nopetahana tamin'ny 9600 × g nandritra ny 30 min, ny pellet dia naverina tamin'ny PBS pH 7.4 ary sonicated (1 min, 50% cycle, 80% amplitude amin'ny Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, Etazonia) santionany fibril. miaraka amin'ny fizarana mitovy habe amin'ny fibrils kely.
Ny famakafakana FCS / FCCS sy ny fahitana kisendrasendra roa loko (TCCD) dia natao tamin'ny mikraoskaopy fluorescent fluorescent mitovy amin'ny MT200 (Pico-Quant, Berlin, Alemaina) ampiasaina amin'ny fanandramana mikroskopika FLIM-FRET amin'ny fampiasana ny fomba PIE.Ny herin'ny laser ho an'ireo andrana ireo dia nampiana 6.0 µW (481 nm) sy 6.2 µW (637 nm).Ny fampifangaroana ireo herin'ny laser ireo dia nofinidy mba hamokatra famirapiratana mitovy amin'ireo fluorophores tsiroaroa ampiasaina rehefa mahatratra ny taham-panisana tsara indrindra ary misoroka ny photobleaching sy ny saturation.Ny fanangonana angon-drakitra sy ny famakafakana dia natao tamin'ny fampiasana ny rindrambaiko SymphoTime64 version 2.3 (PicoQuant, Berlin, Alemaina).
Ny santionan'ny aggregate αS/Tau mitoka-monina azo amin'ny fampiasana LLPS dia arotsaka ao anaty buffer mitoka-monina mankany amin'ny fifantohana monomolecular mety (matetika ny dilution 1: 500, satria ny aggregate dia efa ao anatin'ny fifantohana ambany rehefa mitokana amin'ny santionany coacervate).Ny santionany dia ampiharina mivantana amin'ny coverlips (Corning, Etazonia) voapoizina amin'ny vahaolana BSA amin'ny fifantohana 1 mg / mL.
Ho an'ny famakafakana PIE-smFRET amin'ny fantsona maitso sy mena, dia nampiharina ny tokonam-baravaran'ny hamafin'ny fotony 25 mba hanivana ny mari-pandrefesana ambany vokatry ny hetsika monomeric (mariho fa ny monomera dia mihoatra ny santionany mitambatra raha oharina amin'ny aggregate mitoka-monina).Ity tokonam-baravarana ity dia nokajiana ho avo dimy heny amin'ny salan'isan'ny monomeric αS azo avy amin'ny famakafakana ny santionany monomer madio mba hisafidianana manokana ireo fitambarana ho an'ny fanadihadiana.Ny circuit drive PIE, miaraka amin'ny fahazoana angon-drakitra TSCPC, dia nahafahan'ny fampiharana sivana mavesatra mandritra ny androm-piainana izay manampy amin'ny fanafoanana ny fiaviana sy ny crosstalk spectral.Ny hamafin'ny lelafo nofantenana tamin'ny fampiasana ireo tokonam-baravarana etsy ambony dia nahitsy tamin'ny fampiasana ny mari-pamantarana salan'isa voafaritry ny histograma ny fisehoan-javatra mifanohitra amin'ny hamafin'ny / dabam-baravaran'ny santionany fotsiny.Ny fipoahana mifandray amin'ny aggregate lehibe mazàna dia mibodo koba maromaro misesy ao anatin'ny fandalovan'ny fotoana (apetraka amin'ny 1 ms).Amin'ireo toe-javatra ireo dia nofantenana ny tanjaka ambony indrindra.Ho an'ny fanadihadiana FRET sy stoichiometric, dia nampiasaina ny gamma factor γ (0.517) voafaritra ara-teorika.Ny crosstalk spectral sy ny fandraisana anjara mivantana amin'ny fientanam-po dia tsinontsinona (fantatra amin'ny andrana) amin'ny herin'ny laser excitation ampiasaina.Ny fahombiazana sy ny stoichiometry an'ny FRET amin'ny fipoahana dia kajy toy izao manaraka izao.