310 10 * 1mm Stainless vy coiled Tubing singa simika, Ny sehatra N-terminal ny spidroin mamorona hydrogels mifototra amin'ny amyloid fibrils ary manome sehatra ho an'ny proteinina immobilization.

Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Mampiasa kinova mpitety tranonkala manana fanohanana CSS voafetra ianao.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Ho fanampin'izany, mba hiantohana ny fanohanana mitohy, dia asehoy ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript.
Sliders mampiseho lahatsoratra telo isaky ny slide.Ampiasao ny bokotra aoriana sy manaraka mba hivezivezena amin'ny slides, na ny bokotra mpanara-maso ny slides amin'ny farany mba hivezivezena amin'ny slide tsirairay.

famaritana

310 10*1mm Stainless vy coiled Tubing mpamatsy

Famoronana simika

Toetra mekanika

Ny proteinina landy spider recombinant (proteinina landy spider) dia manana fampiharana maro azo ampiasaina amin'ny famolavolana biomaterial vaovao, saingy ny toetrany multimodal sy mora mitambatra dia mahatonga azy ireo ho sarotra ny hahazoana sy mora ampiasaina.Eto izahay dia mitatitra fa ny proteinina spidroin kely recombinant ary, ny zava-dehibe, ny sehatra N-terminal (NT) dia mamorona haingana hydrogels manohana tena sy mangarahara amin'ny 37 ° C.proteinina fusion ahitana proteinina NT sy maitso fluorescent na purine nucleoside phosphorylase dia mamorona proteinina fusion miasa tanteraka.Hydrogels.Ny vokatra azonay dia mampiseho fa ny proteinina NT sy fusion recombinant dia manome vokatra avo lenta ary manome hydrogels manana toetra manintona toy ny mangarahara, ny gelation tsy misy fifamatorana, ary ny tsy firaharahiana mivantana ny proteinina mavitrika amin'ny hakitroky avo.
Manana fihary landy fito samy hafa ny hala, izay samy mamokatra karazana landy manokana.Ny karazana landy fito rehetra dia ahitana proteinina landy hala (spidroins) manodidina ny 6000 sisa tavela ary misy faritra miverimberina afovoany lehibe voahodidin'ny sehatra N- sy C-terminal (NT sy CT)1,2.Ny karazana landy be fianarana indrindra, ny ampula voalohany, dia novokarin'ny fihary ampulla voalohany.Ao amin'io glandy io, ny monolayer amin'ny sela epithelial dia mamorona proteinina spidroine ary manafina azy ireo ao amin'ny lumen'ny glanda, izay misy azy ireo amin'ny endrika mety levona (doping) amin'ny fifantohana avo dia avo (30-50% w / v)3,4.Ny fandaminana sy ny fampifanarahana ny proteinina spidroin ampullar lehibe ao amin'ny glandy dia niadian-kevitra, fa ny ankamaroan'ny porofo andrana dia manondro ny fisian'ny conformation helical amin'ny ankapobeny sy / na kisendrasendra ary micellar na lamellar structure5,6,7,8,9,10.Raha ny sehatra miverimberina dia mandrindra ny toetra mekanika amin'ny fibre landy, mamorona β-sheet nanocrystals sy amorphous structures11,12,13,14,15, ny sehatra farany dia mifehy ny fibre landy ho setrin'ny fiovan'ny toe-javatra eo amin'ny glandy landy16,17,18.Amin'ny alalan'ny fanaraha-maso ny fiforonan'ny landy, 19. Voatahiry amin'ny evolisiona ny sehatry ny terminal ary mety ho mahazatra amin'ny proteinina spidroine rehetra 2,20,21 ny asany.Mandritra ny fandalovana amin'ny glandy, ny pH an'ny spidroin dia mihena eo amin'ny 7.6 ka hatramin'ny <5.716 ary mitombo miaraka amin'ny fanetezana sy ny fihenjanana entin'ny hetsika amin'ny alàlan'ny lakandrano mihanaka tsikelikely.Amin'ny vahaolana, ny CT dia α-helical constitutive parallèle dimer17, fa ho setrin'ny pH ambany sy ny herim-pandrefesana, ny CT dia mivelatra ary manova ny β-layers16, 17, mety hiteraka β-layers any amin'ny faritra miverimberina ao amin'ny Convert 16. Ny NT dia monomeric eo ambany toe-javatra maneho ny toe-javatra ao amin'ny lumen ny fihary atodinaina sy manelanelana ny solubility ny spidroin, fa amin'ny nihena pH, protonation ny isan'ny carboxylic asidra rojo ny sisiny mitondra any amin'ny dimerization ny NT amin'ny pKa eo ho eo 6.5, amin'izany stabilizing NT sy ny fanamboarana ny spidroin amin'ny lehibe. quantities.tambajotra16,18.Noho izany, ny NT dia manana anjara toerana lehibe amin'ny fananganana filamenta, miova avy amin'ny monomer amin'ny coating ho dimer ao amin'ny fibre23,24,25.Ny NT dia mijanona ho mora levona sy helika amin'ny toe-javatra rehetra nodinihina hatramin'izao16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, izay nanentana ny fivoarany ho mari-pamantarana manatsara ny solubility amin'ny famokarana proteinina heterologous.
Recombinant mini spider silk proteinina, ahitana NT iray, faritra iray miverimberina fohy, CT iray, ary marika His6 (His-NT2RepCT) ho fanadiovana, dia mety levona ao anaty buffer rano toy ny proteinina landy hala voajanahary ary maka tahaka ny toetra manan-danja amin'ny hala landy. .fandrakofana 25.31.Ny His-NT2RepCT dia azo ahodina ho fibre mitohy amin'ny fampiasana milina biomimetika izay misy ny pH 8 azo levona amin'ny rano fandroana pH 525,32,33,34,35.Ny fermentation bioreactor an'ny E. coli maneho ny His-NT2RepCT ary ny fitsaboana taorian'ny fitsaboana dia niteraka vokatra> 14 g / L taorian'ny fanadiovana.Ny vokatra avo, ny solubility avo, ary ny valiny sahaza ny His-NT2RepCT amin'ny toe-javatra misy asidra dia samy nomena ny NT23, 25, 34.
Eto izahay dia mitatitra ny fiforonan'ny hydrogels mangarahara avy amin'ny proteinina spidron recombinant, anisan'izany ny NT irery, amin'ny alàlan'ny fampidirana vahaolana proteinina amin'ny 37 ° C.Amin'ny fampiasana thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) ary transmission electron microscopy (TEM), dia hitanay fa ny proteinina NT sy microspider dia mandalo fiovana ara-drafitra ho β-sheets sy fibrils amyloid. rehefa miforona ny gel.Fanampin'izany, ny proteinina fusion an'ny NT sy ny proteinina fluorescent maitso (GFP) na ny purine nucleoside phosphorylase (PNP) dia mamorona hydrogels miaraka amin'ny sombiny fusion miasa tanteraka.Ny fanehoan-kevitra avo lenta amin'ny mpampiantrano heterologous, miaraka amin'ny fananganana haingana ny hydrogels eo ambanin'ny toe-piainana ara-batana, dia manokatra ny mety hisian'ny famokarana hydrogels amin'ny vidiny mirary miaraka amin'ny asa vita.
Tsy toy ny ankamaroan'ny proteinina spidroin recombinant36, ny His-NT2RepCT dia miorina amin'ny buffer Tris-HCl amin'ny pH 8 ary mety hifantoka hatramin'ny 500 mg / mL tsy misy rotsak'orana25.Noho izany, gaga izahay nahita fa ity proteinina ity dia mamorona haingana hydrogels mazava tsara, izay manohana tena rehefa incubated amin'ny 37 ° C (sary 1b-d).Ny fandinihana fanampiny dia naneho fa ny gelation His-NT2RepCT dia niseho tamin'ny habetsahan'ny proteinina isan-karazany (10-300 mg / mL) ary io fifantohana io dia mifamatotra amin'ny fotoanan'ny gelation (sary 1c sy Supplementary Fig. 1).Mba hahitana hoe iza amin'ireo ampahany amin'ny His-NT2RepCT no manelanelana ny fananganana hydrogel, dia nandinika ny sehatra tsirairay avy izahay ary tamin'ny fitambarana isan-karazany tamin'ny alàlan'ny fitsirihana inversion flask (sary 1a, b).Ny ampahany rehetra voasedra amin'ny spidroin recombinant dia namorona gels (amin'ny proteinina 300 mg / mL) ao anatin'ny 1 ora latsaka, afa-tsy ny 2Rep nipoitra (sary 1b).Izany dia manondro fa ny NT sy CT irery, miaraka, na mifandray amin'ny famerimberenana, dia afaka manao gel amin'ny 37 ° C ary ny marika His6 dia tsy misy fiantraikany amin'ity dingana ity amin'ny lafiny iray.Raha jerena ny fiheverana mahazatra fa ny NT dia proteinina tena levona sy marin-toerana, ary ny tatitra teo aloha momba ny hydrogels spidroin recombinant dia nahatonga ny fiantraikan'ny gelation amin'ny fiovan'ny conformational amin'ny faritra miverimberina sy / na CT, ny NT mihitsy no afaka.Tsy nampoizina ny fahitana ny gelation.Tabilao fanampiny 1) 37, 38, 39. Mahavariana fa ny NT dia efa nipoitra tao anatin'ny 10 minitra tamin'ny fifantohana ≥ 300 mg / mL (sary 1c).Ny fanandramana fanodikodinana vilia miaraka amin'ny fifantohana isan-karazany amin'ny NT dia naneho fa amin'ny> 50 mg / mL ny vahaolana NT dia nalaina haingana kokoa noho ny His-NT2RepCT amin'ny fifantohana mifanaraka amin'izany (w / v, Figure 1c).
Fanehoan-kevitra momba ny fananganana spidron isan-karazany nodinihina tamin'ity asa ity.b Ny fotoana gel amin'ny 37 °C ho an'ny proteinina spidron recombinant isan-karazany (300 mg/mL) voamarina amin'ny famadihana ny vial.CT gel avy hatrany tsy misy incubation (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm scale).c Ny fotoana gel an'ny His-NT2RepCT sy NT amin'ny fifantohana proteinina voalaza ao amin'ny 37 ° C.d Sarin'ny hydrogels His-NT2RepCT sy NT miaraka amin'ny hala sy ny litera "NT" natao pirinty teo ambany, tsirairay avy (samy 200 mg/mL, bara mizana 5 mm).
Ny hydrogels voaforona avy amin'ny proteinina spidron recombinant isan-karazany dia manana loko hafa kely, ary ny fijerena maso mitanjaka dia mampiseho ambaratonga samihafa amin'ny mangarahara (sary 1b).Ny gel NT dia mazava tsara fa ny gel hafa dia lasa manjavozavo.Ny gels-NT2RepCT sy NT natsipy tao anaty fantsona cylindrical dia azo esorina amin'ny bobongolo (sary 1d).
Mba hitsapana raha toa ny gel coatings landy hala voajanahary ao anatin'ny toe-javatra ankehitriny dia hita fa miteraka gelation ny proteinina spidroin recombinant, dia nangonina avy amin'ny glandy ampulla lehibe ny soedoà tetezana hala (Larinioides sclopetarius) ny coatings.Ny coating dia voatahiry ao amin'ny buffer 20 mM Tris-HCl amin'ny 50 mg / mL (mifototra amin'ny lanjan'ny maina), saingy tsy nisy ny gelation hita nandritra ny andro 21 incubation tamin'ny 37 ° C (sary fanampiny 2a).
Mba hamaritana ireo gels ireo, dia azo ampiasaina ny fandrefesana rheolojika handinihana ny fizotran'ny gelation ary hamaritana ny toetra mekanika ankapobeny.Amin'ny ankapobeny, ny fanaraha-maso ny modulus fitehirizana (elasticité) amin'ny mari-pana ambony dia afaka manome fampahalalana momba ny mari-pana gelling ary koa ny toetran'ny viscoelastic amin'ny coating.Ny fanandramana fiakaran'ny mari-pana (mampiasa 1 ° C / min amin'ny 25-45 ° C, mifototra amin'ny fanadihadiana teo aloha tamin'ny fampiasana vahaolana silk voajanahary voajanahary) 40,41 dia naneho fa ny moduli fitehirizana ny vahaolana His-NT2RepCT sy NT dia nitombo tamin'ny fiakaran'ny hafanana.dia nitombo (sary 2 sy sary fanampiny 3).Marihina fa ny maody NT dia nanomboka nitombo tamin'ny mari-pana ambany kokoa raha oharina amin'ny His-NT2RepCT, mifanaraka amin'ny fotoanan'ny gel haingana kokoa hita rehefa niparitaka mivantana tamin'ny His-NT2RepCT ny NT tamin'ny 37 ° C (sary 1).Taorian'ny fihenan'ny mari-pana taorian'izay, ny modulus fitehirizana dia tsy niverina tamin'ny sanda ambany kokoa ary nijanona teo ambonin'ny modulus fatiantoka (jereo ny sary fanampiny 3), izay manondro ny gelation stable tsy azo ovaina.Taorian'ny gelation, ny modulus elastika farany dia avy amin'ny 15 ka hatramin'ny 330 kPa ho an'ny hydrogels His-NT2RepCT amin'ny fifantohana amin'ny 100-500 mg / mL, ary ny modulus elastika farany ho an'ny hydrogels NT (100-500 mg / mL) dia avy amin'ny 2 ka hatramin'ny 1400. kPa (sary 2 ary angon-drakitra feno) jereo ny sary fanampiny 3).
a Fiovan'ny hafanana mandritra ny fandrefesana ny His-NT2RepCT (300 mg/mL) sy b NT (300 mg/mL) miaraka amin'ny fihovitrovitra.Ny zana-tsipìka dia manondro ny fironan'ny mari-pana, ary ny alokaloka maivana kokoa amin'ny angon-drakitra maodely fitahirizana dia mampiseho ny fitsapana amin'ny sandan'ny torque ambany kokoa ho an'ny fitaovana noho ny nofaritan'ny mpanamboatra, izay mahatonga ny tabataba.c Fiangonan'ny mody farany ny His-NT2RepCT sy NT taorian'ny fiakaran'ny hafanana (100, 300, ary 500 mg / mL).Ny famakiana module rehetra dia alaina amin'ny fatran'ny 0.1 Hz.
Amin'ny maha fomba mety hanadihadiana ny fiovan'ny conformational mifandraika amin'ny gelation, dia nandrakitra ny spectra FTIR an'ny His-NT2RepCT sy NT izahay alohan'ny sy aorian'ny gelation amin'ny 37 ° C (sary 3a, b).Araka ny efa nampoizina, ny spectra ny vahaolana His-NT2RepCT sy NT dia mifanitsy amin'ny proteinina mampiseho α-helix / random coil rafitra faharoa, miaraka amin'ny tarika voatonona amin'ny 1645 cm-1.Ho an'ny hydrogels roa, ny gelation dia nahatonga ny fananganana sandry roa tao amin'ny tarika I afovoany eo amin'ny 1617 cm-1 sy 1695 cm-1 (sary 3a, b), izay manondro ny fananganana rafitra β-sheet antiparallel.Ireo fiovana ireo dia azo jerena tsara ihany koa amin'ny spectra derivative faharoa sy ny fahasamihafana (fanampiny 4b).Ny tarika roa amin'ny NT β-layer dia nambara kokoa noho ny an'ny His-NT2RepCT, izay manondro fa ny totalin'ny fitambaran'ny tarika β-layer ao amin'ny hydrogel NT dia avo kokoa noho ny an'ny hydrogel NT2RepCT.
FTIR spectra absorption ny His-NT2RepCT sy b NT (samy 500 mg / mL) alohan'ny (vahaolana) sy aorian'ny (gel) incubation amin'ny 37 ° C.c sarin'ny TEM misy gel 50 mg/ml NT2RepCT sy d NT.Scale bar 200 nm.e Fibre savaivony ny His-NT2RepCT sy NT hydrogels.n = 100 refesina fibrils, p <0.0001.Ny bara misy hadisoana dia mampiseho ny fivilian-dàlana mahazatra.Ny ivon'ny barazy diso dia ny mean.Ny t-test tsy misy tsiroaroa (roa-tailed) dia nampiasaina ho an'ny fanadihadiana statistika.f ThT fluorescence amin'ny proteinina spidron recombinant isan-karazany (100 mg/mL) amin'ny 37 ° C tsy mihozongozona.g NT (100 mg/mL) inoculation andrana avy amin'ny 100 mg/mL NT gel misy voa 0%, 5%, 10% ary 20%.
Ny famakafakana ny gel amin'ny fampiasana microscopy electron transmission (TEM) dia nampiseho fa ny hydrogel dia misy fibrils toy ny amyloid (sary 3c, 3d).Ny fibrils vita amin'ny NT dia lava (5-12 nm amin'ny savaivony) ary tsy misy rantsana, raha ny fibrils His-NT2RepCT kosa dia fohy kokoa ny halavany ary mivelatra kokoa amin'ny diamondra (7-16 nm) (sary 3e).Ireo vokatra ireo dia namela anay hanaraka ny kinetika ny fibrosis amin'ny fampiasana ny thioflavin T (ThT) assay.Ho an'ny proteinina spidron recombinant rehetra, dia nitombo ny mari-pamantarana fluorescent rehefa natsipy tao amin'ny 37 ° C ny santionany (sary 3f, Fig. 5a fanampiny).Mifanaraka amin'io fikarohana io, ny fandinihana mikroskopika momba ny NT sy ny His-NT2RepCT amin'ny toe-javatra mampihoron-koditra dia nanambara ny fitomboan'ny fitomboan'ny ThT fluorescence tsy misy fanangonam-bokatra eo an-toerana amin'ny ThT-positive aggregates (fanampiny sary 5b, c).Ny fananganana fibrils ThT-positive dia tsy niaraka tamin'ny fitomboan'ny NT sy ny His-NTCT turbidity (fanampiny Fig. 5d), izay midika fa ny tambajotra fibrils ao amin'ny gel dia afaka miforona tsy mampandefitra ny mazava gel.Ny famafazana amin'ny fampifangaroana fibrils efa novolavolaina kely dia afaka manafaingana be ny fibrillation amin'ny amyloids sasany42,43,44 fa manampy 5%, 10% na 20% (w/w) NT amin'ny vahaolana amin'ny hydrocoagulants NT.vokatry ny famafazana (sary 3g).Angamba izany dia noho ny zava-misy fa ny fibrils ao amin'ny hydrogel dia somary raikitra ary tsy azo ampiasaina ho voa.
Ny fihetsika tsy nampoizina amin'ny proteinina spidroin recombinant amin'ny hafanana avo dia nanosika ny fandalinana spectroscopy nokleary magnetic resonance (NMR) mba hamantarana ny fiovan'ny conformational mifandray amin'ny fananganana gel.NMR spectra ny vahaolana His-NT2RepCT voarakitra an-tsoratra nandritra ny fotoana ela tao amin'ny 37 ° C dia mampiseho fa ny CT dia mbola mivalona amin'ny ampahany, fa ny NT sy 2Rep famantarana dia nanjavona (sary 4a), izay nanoro hevitra fa ny ankamaroan'ny NT sy 2Rep izay mifehy ny fananganana ny His- NT2RepCT hydrogel.Ny mari-pamantarana CT dia nahena ho 20% amin'ny hamafin'ny tany am-boalohany, izay nanoro hevitra fa ny CT dia raikitra ihany koa ary tafiditra ao anatin'ny rafitra hydrogel.Ho an'ny ampahany kely kokoa amin'ny CT, izay finday toy ny ao amin'ny sample preincubated ary noho izany dia voamariky ny vahaolana NMR, ny spectra dia tsy manana famantarana ho an'ny sisa tavela 10 voalohany, angamba noho ny tsy fihetsehana sarotra ny ampahany mifatotra amin'ny His-NT2Rep.Ny spectra NMR amin'ny -state of hydrogels -NT2RepCT dia nanambara ny fisian'ny α-helices sy β-layers ary, amin'ny kely kokoa, ny conformation coil kisendrasendra (sary 4b).Ny famakafakana ny fiovan'ny simika momba ny sisa tavela amin'ny methionine tsy misy afa-tsy ao amin'ny NT dia nampiseho fa io sehatra io dia niova ho rafitra β-sheet.Ny spectra miankina amin'ny fotoanan'ny NT amin'ny vahaolana dia nampiseho fihenam-bidy mitovy amin'ny hamafin'ny mari-pamantarana (sary 4c), ary ny NMR amin'ny hydrogels NT dia nampiseho fa ny ankamaroan'ny sisa tavela amin'ny NT dia niova ho rafitra β-sheet (sary 4d).Ny fampifanarahana ny 2Rep dia tsy azo faritana misaraka noho ny fironany mitambatra.Na izany aza, ny spectra solide NMR amin'ny hydrogels NTCT sy His-NT2RepCT dia nitovy be (sary 4b; Fig. 6b fanampiny), izay manoro hevitra fa ny 2Rep dia nandray anjara kely tamin'ny ampahany ara-drafitra ny hydrogel His-NT2RepCT.Ho an'ny hydrogels CT, ny α-helices, ny β-sheets, ary ny rafitra faharoa helical kisendrasendra dia hita fa misy (Fig. 6d fanampiny).Izany dia manondro fa ny ampahany sasany amin'ny CT dia mijanona ho α-helice raha ny hafa kosa lasa β-sheet.Noho izany, ny valin'ny spectroscopy NMR dia manondro fa ny NT dia zava-dehibe amin'ny fananganana hydrogel ary miova ho toy ny β-sheet conformation amin'ny fusion miaraka amin'ny 2Rep sy CT.Mifanaraka amin'izany dia hitanay vao haingana fa ny zippers spatial amyloid dia mety miforona amin'ny helika dimy amin'ny sehatra NT, ary ny algorithm Waltz dia naminavina faritra amyloidogenic ao amin'ny helix 1 (sary 4e).
2D spectra of 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT solution mialoha (manga) ary 19 ora aorian'ny incubation (mena) amin'ny 37°C.Ny tampon'ny lakroa tsirairay ao amin'ny spectrum mena ary ny F24, G136, polyA amin'ny spectrum manga dia aseho amin'ny litera tokana asidra amine sy ny isa sisa.Ny insets dia mampiseho ny fiankinan'ny hamafin'ny famantarana amin'ny fotoana ho an'ny sisa voafantina avy amin'ny sehatra NT, 2Rep, ary CT.b Spectra radiofrequency solid-state (RFDR) an'ny hydrogels His-NT2RepCT.Ny fifandraisana amin'ny sisa tavela Cα / Cβ hita ao amin'ny spectra RFDR dia nofaritana tamin'ny fampitahana ny fiovan'ny simika peptide modely sy ny soatoavina azo avy amin'ny statistika82,83 sy ny rafitra faharoa.SSB - rotating sideband.c spektra tokana amin'ny vahaolana 15N-HSQC 10 mg/mL NT mandritra ny incubation amin'ny 37 ° C mandritra ny 36 ora.Ny inset dia mampiseho ny hamafin'ny volumetric mifanohitra amin'ny fotoana.d.Ny fifandraisan'ny sisa tavela Cα / Cβ sy ny rafitra faharoa hita ao amin'ny spectra RFDR dia aseho.e Miorina amin'ny mombamomba ny fibrillation NT45.79 avy amin'ny angon-drakitra Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Ny angovo Rosetta amin'ny varavarankelin'ny tselatra spatial amin'ny hexapeptide dia aseho amin'ny kcal/mol.Ny bara mena dia manondro hexapeptides manana fironana fibrosis avo (angovo Rosetta ambany -23 kcal / mol; eo ambanin'ny tsipika misy teboka).Ny bara maitso dia manondro sombintsombiny miaraka amin'ny angovo Rosetta eo ambonin'ny tokonana ary noho izany dia tsy dia azo inoana loatra ny hamorona zipper steric.Ny sombintsombiny misy proline dia nesorina tamin'ny fanadihadiana (tsy misy tsanganana).Ny efamira dia manondro faritra misy amyloidose nambaran'ny Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).Eo an-tampony ny filaharan'ny sisa tavela amin'ny asidra amine an'ny NT, ary aseho amin'ny loko mena ireo karazana sisa hita ao amin'ny rafitra faharoa β (voafaritry ny spectroscopy NMR solid-state).Ny toeran'ireo helika dimy NT α dia voatondro ho (H1-H5)28.
Amin'ny pH <6.5, ny HT dia mihamalemy, mahatohitra ny hafanana na ny urea-induced denaturation18.Mba hanazavana ny fiantraikan'ny dimerization sy ny fahamarinan'ny NT amin'ny gelation, ny vahaolana misy 100 mg / ml NT dia nofehezina tamin'ny pH 8, 7, ary 6 tamin'ny fampiasana ny fitsapana fanodikodinana vial.NT santionany incubated amin'ny pH 8 sy 7 gelled taorian'ny 30 min amin'ny 37 ° C, fa ny pH 8 gel nijanona mazava, raha ny pH 7 gel nampiseho etona hita maso (sary 5a).Mifanohitra amin'izany kosa, ny vahaolana misy HT amin'ny pH 6 dia tsy namorona gel, ary mety ho hita ny elatra lehibe rehefa afaka 20 minitra amin'ny 37 ° C.Izany dia manondro fa ny dimer ny tenany sy / na ny fahamarinany ambony kokoa raha oharina amin'ny monomer dia manakana ny gelation.Tsy nampoizina ny fananganana entona ho an'ny NT amin'ny pH 7 sy 6, satria voalaza fa ny NT dia levona amin'ny 200 mg / ml27, mora miverimberina aorian'ny fihenan'ny hafanana, ary mitazona α-helix amin'ny sanda ambany kokoa. pH 18. Ny fanazavana azo inoana momba ireo tsy fitoviana ireo dia ny hoe ny fanandramana voalaza teo aloha dia natao tamin'ny mari-pana na ambany, na tamin'ny fatran'ny proteinina somary ambany16,18,19.
NT vial inversion test (100 mg/mL) amin'ny pH 8, 7, 6 ary 154 mM NaCl (pH 8) aorian'ny incubation amin'ny 37 ° C.b NT CD spectra misy sy tsy misy 154 mM NaF sy 154 mM NaCl, tsirairay avy.Ny ellipticity molar amin'ny 222 nm dia miova ho ampahany amin'ny vala voajanahary.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C sy 60 °C), NTA72R (37 °C), ary His-NT-L6 (37 °C sy 60 °C).d CD spectra an'ny NT mutants NT*, NTA72R, ary His-NT-L6.Ny ellipticity molar amin'ny 222 nm dia miova ho ampahany amin'ny vala voajanahary.e Fitsapana fanodikodinana ny NTFlSp, NTMiSp ary ny fihenan'ny NTMiSp (100 mg/mL).Scale bar 5 mm.f CD spectra an'ny NT, NTFlSp, NTMiSp ary NTMiSp mihena.Ny ellipticity molar amin'ny 222 nm dia miova ho ampahany amin'ny vala voajanahary.Ny spectra NT feno amin'ny 25 ° C sy 95 ° C dia aseho amin'ny sary fanampiny 8.
Ny fifantohana sira ara-batana dia mamaritra ny fifandraisana elektrôstatika eo amin'ny subunits NT sy ny dimerization ny famindrana NT mankany amin'ny pH18 ambany.Hitanay fa ny fisian'ny 154 mM NaCl sy NaF dia tena nanakana ny gelation, tsirairay avy (sary 5a, b; Fig. 2b fanampiny) ary ireo sira ireo dia nampitombo ny fahamarinan'ny NT monomers (sary 5b, Fig. 8 fanampiny) .Manoro hevitra ihany koa izy fa ny fanamafisana ny fahamarinan-toerana, fa tsy ny dimerization, dia manakana ny fananganana gel.
Mba hijerena bebe kokoa ny anjara asan'ny dimerization proteinina sy ny fahamarinan-toerana amin'ny gelation, dia nampiasa mutant roa izahay, NT * ary NTA72R, izay mijanona ho monomeric ihany koa amin'ny pH28.30 ambany.Ny NT* dia mutant mamadika fiampangana indroa izay mipetaka ny fizarana fiampangana dipolar amin'ny monomer, izay manakana ny dimerization ary mampitombo be ny fahamarinan'ny monomer.Ny NTA72R dia dipole misy fiampangana, fa ny Ala voasolo Arg kosa dia eo amin'ny sisin-tany dimer, noho izany dia manelingelina ny fifandraisan'ny subunit ilaina amin'ny dimerization ny mutations.Rehefa incubation tamin'ny 37 ° C, ny NT * dia tsy namorona hydrogel, raha ny NTA72R dia namorona gel opaque nandritra ny 15 min (sary 5c).Koa satria ny NT* sy ny NTA72R dia tsy afaka mi-dimerize fa tsy mitovy amin'ny fahamarinan'ny monomer (sary 5d), ireo vokatra ireo dia manoro hevitra mafy fa ny fahamarinan'ny thermodynamika avo dia manakana ny NT amin'ny gel.Izany koa dia tohanan'ny hoe ny HT* dia mamorona gel rehefa tsy miorina amin'ny hafanana ambony (aorian'ny 8 min amin'ny 60 ° C; sary 5c).Efa naseho teo aloha fa ny avo lenta amin'ny methionine ao amin'ny NT dia manalefaka ny fiforonan'ny voajanahary ary ny solon'ny Met to Leu enina (antsoina eto hoe His-NT-L6) dia manamafy mafy ny monomer NT46.Miorina amin'ny fiheverana fa ilaina ny flexibility ara-drafitra amin'ny fananganana gel NT, dia hitanay fa ny mutant stable His-NT-L6 dia tsy nipoitra tamin'ny 37 ° C (sary 5c, d).Na izany aza, ny His-NT-L6 dia namorona gel ihany koa rehefa incubation tamin'ny 60 ° C nandritra ny 60 min (sary 5c).
Ny fahafahan'ny NT miova ho rafitra β-sheet sy mamorona hydrogels dia toa mihatra amin'ny sasany fa tsy amin'ny sehatra NT rehetra amin'ny spidroin.Ny NT avy amin'ny karazana landy samihafa sy karazana hala, Trichonephila clavipes (NTFlSp), dia namorona gel na dia eo aza ny votoatiny methionine somary ambany sy ny fahamarinan-toerana mafana (sary 5e, f ary tabilao fanampiny 2).Mifanohitra amin'izany kosa, ny NT avy amin'ny spidroin proteinina kely ampullar avy amin'ny Araneus ventricosus (NTMiSp) miaraka amin'ny fahamarinan-toerana ambany sy ny votoatin'ny methionine avo dia tsy namorona hydrogels (Tabilao fanampiny 2 sy sary 5e, f).Ity farany dia mety mifandray amin'ny fisian'ny fatorana disulfide intramolecular29,47.Mifanaraka, rehefa nihena ny fatorana disulfide an'ny NTMiSp, dia namorona hydrogel izy taorian'ny incubation tamin'ny 37 ° C nandritra ny 10 min (sary 5e).Ho fehin-kevitra, tokony ho marihina fa ny flexibilité ara-drafitra dia zava-dehibe, fa tsy ny hany tokana, fepetra momba ny fananganana gel avy amin'ny NT.Ny antony iray hafa mety ho ilaina dia ny fironana hamorona fibrils amyloid, ary ny famakafakana miaraka amin'ny angon-drakitra zipper sy ny algorithm Waltz dia nampiseho fifandraisana misy eo amin'ny fahafahana mamorona gels sy ny fisian'ny faritra amyloidogenic, ary koa ny halehiben'ny faritra voalaza mialoha. mba hamorona zippers steric.Nisy fifamatorana (Tabilao fanampiny 2 sy sary fanampiny 9).
Ny fahafahan'ny NT mamorona fibrils sy mamorona gel ao anatin'ny toe-javatra tsara dia nahatonga antsika hihevitra fa ny fusions NT miaraka amin'ny sombin-tsakafo hafa dia mbola afaka mamorona gel miaraka amin'ny fiasan'ny mpiara-miombon'antoka feno.Mba hitsapana izany dia nampiditra proteinina fluorescent maitso (GFP) sy purine nucleoside phosphorylase (PNP) ao amin'ny C-terminus an'ny NT izahay.Ny proteinina fusion vokatr'izany dia naseho tao amin'ny E. coli miaraka amin'ny vokatra farany avo be (150 mg / L sy 256 mg / L kolontsaina tavoara ho an'ny His-NT-GFP sy His-NT-PNP, tsirairay avy), mifanaraka amin'izay naseho. ho an'ny proteinina hafa mitambatra amin'ny NT Ref.30. Ny proteinina fusionan'ny His-NT-GFP (300mg/mL) sy ny His-NT-PNP (100mg/mL) dia niforona gel taorian'ny adiny 2 sy 6.5 ora tamin'ny 37°C ary ny zava-dehibe dia tsy niova ny ampahany GFP.voamarika taorian'ny gelation, miaraka amin'ny> 70% ny hamafin'ny fluorescence voalohany sisa tavela aorian'ny gelation (sary 6a).Mba handrefesana ny hetsika PNP amin'ny vahaolana sy ny gels-NT-PNP, dia tsy maintsy nalevinay ny proteinina fusion miaraka amin'ny NT satria ny hetsika enzymatic amin'ny fanomanana madio dia ivelan'ny faritry ny fitiliana amin'ny fifantohana gelling.Ny gel noforonina miaraka amin'ny fifangaroana misy 0.01 mg / mL His-NT-PNP sy 100 mg / mL NT dia nitazona 65% amin'ny hetsika enzymatic voalohany amin'ireo santionany efa voaomana (sary 6b).Ny gel dia nijanona tsy tapaka nandritra ny fandrefesana (Fig. 10 fanampiny).
Ny hamafin'ny fluorescence havanana alohan'ny sy aorian'ny famafazana ny His-NT-GFP (300 mg / mL) ary ny vial inverted misy ny hydrogel His-NT-GFP (300 mg / mL) eo ambanin'ny hazavana hita maso sy UV.Ny teboka dia mampiseho ny fandrefesana tsirairay (n = 3), ny barazy diso dia mampiseho fivilian-dàlana mahazatra.Ny sandan'ny salan'isa dia aseho eo afovoan'ny barazy diso.b Ny hetsika PNP dia azo tamin'ny famakafakana fluorometrika tamin'ny fampiasana vahaolana sy gel misy NT (100 mg / ml) ary fifangaroana misy 0,01 mg / ml ny-NT-PNP sy 100 mg / ml New Taiwan dollars.Ny sisiny dia mampiseho vial mivadika misy hydrogel misy His-NT-PNP (barony mizana 5 mm).
Eto izahay dia mitatitra ny fiforonan'ny hydrogels avy amin'ny NT sy ny proteinina spidroin recombinant hafa amin'ny alàlan'ny fampidirana vahaolana proteinina amin'ny 37 ° C (sary 1).Asehontsika fa ny gelation dia mifandray amin'ny fiovan'ny α-helices ho β-layers sy ny fananganana fibrils toy ny amyloid (sary 3 sy 4).Mahagaga ity fikarohana ity satria ny NTs dia fehezam-boninkazo dimy-helix mihodinkodina fantatra amin'ny maha-avo lenta azy sy ny fahamarinany avo lenta amin'ny fifantohana> 200 mg / mL amin'ny 4 ° C mandritra ny andro maromaro27.Ankoatr'izay, ny NTs dia miverina mora foana aorian'ny denaturation hafanana amin'ny fatran'ny proteinina ambany amin'ny µM.Araka ny vokatra azonay, ny fananganana fibril dia mitaky fitambaran'ny > 10 mg/mL ny proteinina sy ny mari-pana ambony kokoa (sary 1).Izany dia mifanaraka amin'ny hevitra hoe ny amyloid fibrils dia afaka miforona avy amin'ny globularly miforitra proteinina izay ao amin'ny ampahany tsy mivelatra noho ny hafanana mafana ao anatin'ny toe-piainana ara-batana 48.Ohatra amin'ny proteinina izay mandalo io fiovam-po io dia misy insuline49,50, β2-microglobulin, transthyretin ary lysozyme51,52,53.Na dia α-helix aza ny NT, eo amin'ny 65% ​​amin'ny rojo polypeptide dia mifanaraka amin'ny fananganana zipper steric (sary 4e) 45.Koa satria ny monomer dia dynamically mobile46, dia afaka mampiharihary ireo faritra amyloidogenic mety amin'ny mari-pana ambony antonony ary amin'ny fifantohana avo ny totalin'ny proteinina dia mety hahatratra ny tena zava-dehibe ho an'ny amyloid fibril formation54.Taorian'io fanjohian-kevitra io dia nahita fifandraisana ratsy teo amin'ny fifantohana spidroin sy ny fotoana gelation (sary 1c) izahay, ary raha miorina amin'ny fiovan'ny NT ny monomeric NT na amin'ny mutations (NT *, His-NT-L6) na amin'ny fanampiana sira, dia afaka misoroka ny hydrogels fananganana (sary 5).
Amin'ny ankabeazan'ny toe-javatra, ny fibrils amyloid dia manjavona amin'ny vahaolana ho toy ny entona, saingy amin'ny toe-javatra sasany dia afaka mamorona hydrogels55,56,57.Ny fibrils mamorona hydrogel amin'ny ankapobeny dia manana endrika avo lenta ary mamorona tamba-jotra telo dimanjato miorina amin'ny alàlan'ny fikorontanan'ny molekiola, 55,58 mifanaraka amin'ny valiny.Ho an'ny fananganana hydrogel amin'ny vitro, ny proteinina dia matetika mivelatra tanteraka na ampahany, ohatra, amin'ny alàlan'ny fiparitahan'ny solvents organika, ny hafanana avo (70-90 ° C) ary / na ny pH ambany (1.5-3.0) 59,60,61,62.Ny hydrogels spidroin voalaza eto dia tsy mitaky fanodinana henjana, ary tsy mila fitaovana fampitandremana mba hampitony ny hydrogels.
Efa voalaza teo aloha fa miverimberina ny spidroin ary ny QDs, izay toa mandalo fiovan'ny β-sheet mandritra ny fanodinana landy, dia mamorona hydrogels.Raha ampitahaina amin'ny zavatra hitanay, ny fotoana incubation sy / na ny mari-pana amin'ny incubation dia lava kokoa na avo kokoa, ary matetika ny hydrogels dia manjavozavo (sary 7 sy tabilao fanampiny 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Ho fanampin'ny fotoanan'ny gel haingana, ny hydrogels NT> 300 mg / mL (30%) dia nihoatra ny hydrogels proteinina silk recombinant hafa voalaza etsy ambony, ary koa ny hydrogel voajanahary toy ny gelatin, alginate (2%), agar (0,5 %). ) ary collagen.(0.6%) (sary 7 sy tabilao fanampiny 1 sy 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Ny fotoana gel sy ny modulus elastika amin'ny hydrogels amin'ity fandalinana ity dia nampitahaina tamin'ny hydrogels mifototra amin'ny spidroin hafa sy ny hydrogel voajanahary voafantina.Ny fanondroana dia omena miaraka amin'ny famaritana ny fepetran'ny gelation.APS Ammonium persulfate, mari-pana amin'ny efitrano.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Ny hala dia toa namolavola fomba hisorohana ny spidroine tsy ho lasa gel mandritra ny fitahirizana.Na dia eo aza ny habetsahan'ny proteinina ao amin'ny fihary landy, ny faritra miverimberina lehibe mifandray amin'ny sehatra terminal dia midika fa ny fifantohana hita amin'ny NT sy CT ao amin'ny glanda dia mifanitsy amin'ny 10-20 mg / ml eo ho eo, eo amin'ny sisin'ity fandalinana ity.ilaina amin'ny fananganana hydrogel in vitro.Fanampin'izany, ny fifantohana mitovy amin'ny sira 16 dia nanamafy ny NT, toy ny amin'ny fihary landy (sary 5b).Ny conformation NT dia nodinihina tao amin'ny cytosol E. coli ary hita fa miforitra mafy kokoa noho ny rehefa nodinihina in vitro, izay manondro fa ny sira na ny antony hafa dia manakana ny fanangonana azy ao amin'ny vivo.Na izany aza, ny fahafahan'ny NTs hiova ho fibrils β-sheet dia mety ho zava-dehibe amin'ny fananganana filamenta ary tokony hodinihina amin'ny fianarana ho avy.
Ho fanampin'ny endrika vaovao momba ny fibril sy hydrogel toy ny NT-amyloid hita ao amin'ity fandalinana ity, dia asehontsika ihany koa fa io trangan-javatra io dia mety misy fampiharana biotechnologique sy biomedical (sary 8).Ho porofon'ny foto-kevitra dia nampifangaro ny NT tamin'ny GFP na PNP izahay ary nasehonay fa ny proteinina fusion koa dia mamorona hydrogels rehefa miditra amin'ny 37 ° C ary ny ampahany amin'ny GFP sy PNP dia mitazona ny asany aorian'ny gelation (sary 6).Nucleoside phosphorylases dia manan-danja catalyst synthesis ny nucleoside analogues75, izay mahatonga ny zavatra hitanay ho manan-danja amin'ny indostria biopharmaceutical.Ny foto-kevitry ny fanehoana proteinina fusion izay mamorona hydrogel mangarahara ao anatin'ny fepetra tsara dia mamela ny famoronana hydrogels miasa miaraka amin'ny fananana mahasoa ho an'ny fampiharana isan-karazany toy ny immobilization anzima, ny famotsorana zava-mahadomelina voafehy ary ny engineering tissue.Fanampin'izany, ny NT sy NT* dia marika fanehoana mahomby30, izay midika fa ny NT sy ny karazany misy azy dia azo ampiasaina amin'ny famokarana avo lenta amin'ny proteinina fusion mety levona ary ny famoronana proteinina kendrena tsy mihetsika ao anaty hydrogels 3D.
Ny NT dia mety levona, α-helical ary miorina amin'ny hafanana ambany (µM) ary 37 ° C.Amin'ny hafanana mitovy, fa amin'ny fitomboan'ny fifantohana (> 10 mg / ml), ny NT dia mamorona gel misy fibrils toy ny amyloid.Ny proteinina fusion NT ihany koa dia mamorona gel fibrillar miaraka amin'ny sombin-tsolika fusion miasa tanteraka, mamela ny proteinina isan-karazany tsy hihetsika ao anaty hydrogels 3D mampiasa NT.Ambany: NT (PDB: 4FBS) sy sary momba ny tamba-jotra fibre sy ny rafitra proteinina mifandray (heverina fa tsy voasarika amin'ny mizana, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Ny fananganana (jereo ny tabilao fanampiny 4 ho an'ny lisitra feno ao anatin'izany ny fizotry ny asidra amine) dia nalaina tamin'ny plasmid pT7 ary niova ho E. coli BL21 (DE3).Ny E. coli misy plasmids injeniera dia natsipy tao anaty ron-kena Luria nampiana kanamycin (70 mg / l) ary nambolena nandritra ny alina tamin'ny 30 ° C sy 250 rpm.Ny kolontsaina avy eo dia natsipy 1/100 tao amin'ny medium LB misy kanamycin ary nambolena tamin'ny 30 ° C sy 110 rpm mandra-pahatongan'ny OD600 0,8.Ho an'ny fandalinana NMR, ny bakteria dia nitombo tao amin'ny medium M9 minimum misy 2 g ny D-glucose 13C (Aldrich) ary 1 g ny ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ho an'ny fametahana proteinina miaraka amin'ny isotopes.Ampidino hatramin'ny 20 degre Celsius ny mari-pana ary mamporisika ny fanehoana proteinina amin'ny 0,15 mM isopropylthiogalactopyranoside (fifantohana farany).Taorian'ny fanehoana proteinina nandritra ny alina, ny sela dia voaangona tamin'ny 7278 × g, 4 ° C nandritra ny 20 min.Ny pellets sela dia naverina naverina tamin'ny 20 mM Tris-HCl, pH 8, ary nafangaro mandra-pampiasaina bebe kokoa.Ny sela natsofoka dia nopotehina tamin'ny fampiasana mpanelingelina sela (milina andiany TS, Constant Systems Limited, Angletera) amin'ny 30 kPa.Avy eo ny lysate dia nodiovina tamin'ny 25.000 g nandritra ny 30 minitra tamin'ny 4 ° C.Ho an'ny NTMiSp, ny pellet dia naverina naverina tamin'ny 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ary sonicated nandritra ny 2 min (2 s on / off, 65%), avy eo dia naverina indray tamin'ny 25,000 xg, 4 ° C. 30 min.Ny supernatant dia nampidirina teo amin'ny tsanganana Ni-NTA, nosasana tamin'ny 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, ary farany ny proteinina dia nalaina tamin'ny 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Mba hamoronana NT2RepCT sy NTCT, thrombin digestion dia mampiditra ny tranokala (ThrCleav) eo anelanelan'ny His sy NT.Ny tranokalan'ny cleavage thrombin dia misy ihany koa ao amin'ny His-NT-ThrCleav-2Rep (mamokatra 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (mamokatra NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (mamokatra CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (mamokatra NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (mamokatra NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (mamokatra NTF1Sp), ary His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (mamokatra NTMiSp).Ny fanorenana dia levonina amin'ny thrombin (1: 1000) ary nalaina nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C. miaraka amin'ny 20 mM Tris-HCl, pH 8, amin'ny fampiasana membrane dialyse Spectra / Por miaraka amin'ny fetran'ny molekiola 6-8 kDa.Aorian'ny dialyse dia ampidirina ao amin'ny tsanganana Ni-NTA ny vahaolana ary angonina ny entona misy proteinina mahaliana.Ny fatran'ny proteinina dia nofaritana tamin'ny fandrefesana ny fatran'ny UV amin'ny 280 nm amin'ny fampiasana ny coefficient lany tamingana ny proteinina tsirairay, afa-tsy ny NTF1Sp, izay nampiasa ny Bradford assay araka ny protocol ny mpanamboatra.Ny fahadiovana dia nofaritan'ny SDS polyacrylamide (4-20%) gel electrophoresis sy Coomassie brilliant blue staining.Ny proteinina dia nifantoka tamin'ny fampiasana sivana centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) amin'ny 4000 xg miaraka amin'ny fanapahana lanja molekiola 10 kDa ao anatin'ny cycles 20 minitra.
Atsofohy ny vahaolana proteinina ary apetaho tsara ny 150 µl ao anaty vial septum mazava 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Nofonosina sy nofehezina tamin'ny parafilm ireo fantsona mba hisorohana ny etona.Ny santionany (n = 3) dia natsipy tao amin'ny 37 ° C na 60 ° C ary navadika tsindraindray mba hijerena ny gelation.Ny santionany tsy misy gel dia natsipy nandritra ny herinandro farafahakeliny.Ahena ny fatorana disulfide NTMiSp miaraka amin'ny 10 mM DTT isaky ny proteinina 10 µM.Mba handinihana ny gelation amin'ny coatings landy hala voajanahary, notapatapahina ny hala tetezana soedoà, napetraka tao amin'ny 200 μl an'ny 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 ny fihary ampullated roa lehibe ary notapatapahina mba hamela ny coating hisaraka amin'ny glands..Ny votoatin'ny glandy dia levona ao anaty buffer, 50 µl ho an'ny famaritana ny lanjan'ny maina (amin'ny alàlan'ny incubation ny vials misokatra amin'ny 60 °C hatramin'ny lanjany tsy tapaka) ary 150 µl ho an'ny gelation amin'ny 37 °C.
Ny geometry / fitaovana fandrefesana dia vita amin'ny vy tsy misy pentina mampiasa takelaka mifanitsy amin'ny savaivony ambony 20 mm ary elanelana 0,5 mm.Atsofohy amin'ny 25 °C hatramin'ny 45 °C ny santionany ary avereno amin'ny 25 °C amin'ny tahan'ny 1 °C isa-minitra amin'ny fampiasana takelaka Peltier ambany vy.Ny fandrefesana vibrational dia natao tamin'ny fatran'ny 0.1 Hz ary tao amin'ny faritra viscoelastic linear amin'ny fitaovana amin'ny tebiteby 5% sy 0.5% ho an'ny santionany 100 mg / mL sy 300-500 mg / mL, tsirairay avy.Mampiasà efitra hamandoana manokana mba hisorohana ny etona.Ny data dia nodinihina tamin'ny fampiasana Prism 9.
Ho fanangonana spectra infrarouge (IR) amin'ny mari-pana amin'ny efitrano 800 hatramin'ny 3900 cm–1.Ny fitaovana ATR, ary koa ny lalana maivana amin'ny alàlan'ny spektrometer, dia diovina amin'ny rivotra voasivana maina mialoha sy mandritra ny andrana.Ny vahaolana (500 mg / mL mba hampihenana ny tampon'ny fidiran'ny rano ao amin'ny spectra) dia napetaka teo amin'ny kristaly, ary ny gels (500 mg / mL) dia niforona talohan'ny fandrefesana ary avy eo nafindra tany amin'ny kristaly (n = 3).Ny scans 1000 dia voarakitra miaraka amin'ny famahana ny 2 cm-1 ary ny tsingerin'ny adidy aotra 2. Ny derivative faharoa dia nokajiana tamin'ny fampiasana OPUS (Bruker) tamin'ny fampiasana teboka sivy.Ny spectra dia natao ara-dalàna amin'ny faritra fampidirana mitovy eo anelanelan'ny 1720 sy 1580 cm-1 mampiasa F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Ao amin'ny spectroscopy ATR-IR, ny halalin'ny taratra infrarouge ao anaty santionany dia miankina amin'ny laharan'ny onjam-peo, ka miteraka fisondrotana mahery kokoa amin'ny isa ambany kokoa noho ny amin'ny isa ambony.Ireo vokatra ireo dia tsy voahitsy ho an'ny spectra aseho ao amin'ny Fig.3 satria kely dia kely izy ireo (Fig. 4 fanampiny).Ny spectra voahitsy ho an'ity tarehimarika ity dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny rindrambaiko Bruker OPUS.
Amin'ny maha-fitsipika, azo atao ny fampitomboana feno ny conformations proteinina aorian'ny deconvolution azo itokisana ny singa ao amin'ny amide I peak.Na izany aza, misy sakana mipoitra amin'ny fampiharana.Ny tabataba ao amin'ny spectrum dia mety hiseho toy ny tampon'isa (diso) mandritra ny deconvolution.Ankoatra izany, ny tampon'isa noho ny fikorianan'ny rano dia mifanitsy amin'ny toeran'ny amide I peak ary mety manana halehibe mitovy amin'ny santionany misy rano be dia be, toy ny gel aqueous nodinihina teto.Noho izany, tsy nanandrana nanimba tanteraka ny amide I peak izahay, ary ny fandinihanay dia tokony hoheverina ho fanohanana ny fomba hafa toy ny spectroscopy NMR.
Ny vahaolana amin'ny 50 mg / ml NT sy ny His-NT2RepCT dia nalaina nandritra ny alina tamin'ny 37 ° C.Ny hydrogel avy eo dia nolevonina tamin'ny 20 mM Tris-HCl (pH 8) ka hatramin'ny 12,5 mg / ml, voahozongozona tsara ary natsofoka mba hanapaka ny gel.Avy eo, ny hydrogel dia nalevina in-10 tamin'ny 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl ny santionany dia napetaka tamin'ny tady varahina voarakotra amin'ny formvar, ary nesorina tamin'ny taratasy famafazana ny santionany tafahoatra.Ny santionany dia nosasana indroa tamin'ny rano MilliQ 5 µl ary nolokoina tamin'ny format uranyl 1% nandritra ny 5 minitra.Esory amin'ny taratasy misoroka ny tasy be loatra, ary maina ny harato.Ny sary dia natao tamin'ireo grids ireo tamin'ny fampiasana FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN miasa amin'ny 100 kV.Ny sary dia voarakitra amin'ny x 26,500 sy x 43,000 magnification tamin'ny fampiasana fakantsary Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Alemaina).Ho an'ny santionany tsirairay (n = 1), sary 10-15 no voarakitra.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) dia nampiasaina tamin'ny famakafakana sary sy fandrefesana ny savaivony fibre (n = 100, fibre samihafa).Ny Prisma 9 dia nampiasaina hanaovana fitiliana t tsy misy mpivady (roa rambony).Ny mean His-NT2RepCT sy NT fibrils dia 11.43 (SD 2.035) ary 7.67 (SD 1.389) nm.Ny elanelana fahatokisana (95%) dia -4.246 hatramin'ny -3.275.degre fahalalahana = 198, p <0.0001.
80 µl santionany ranon-javatra misy 10 µM thioflavin T (ThT) no refesina amin'ny triplicate (n = 3) eo ambanin'ny toe-javatra static mampiasa Corning 96-lavaka mainty ambany ambany takelaka mazava (Corning Glass 3881, Etazonia).Ny fahasamihafan'ny fluorescence dia voarakitra amin'ny fampiasana sivana 440 nm excitation sy sivana emission 480 nm (FLUOStar Galaxy avy amin'ny BMG Labtech, Offenburg, Germany).Ny mari-pamantarana ThT dia tsy tototry na vonoina, satria ny fanandramana amin'ny fifantohana samihafa amin'ny ThT dia natao nefa tsy nanova ny hamafin'ny famantarana.Raketo amin'ny 360 nm ny fandrefesana ny zavona.Ho an'ny fanandramana famafazana, ny gel 100 mg / mL dia niforona tamin'ny 37 ° C., naverina naverina, ary nampiasaina tamin'ny famafazana amin'ny tahan'ny molar 5%, 10% ary 20%.Ny data dia nodinihina tamin'ny fampiasana Prism 9.
Atsofohy amin'ny ranomandry ny tahiry His-NT2RepCT sy NT>100 mg/mL ary sivana amin'ny sivana 0,22 µm.Ny fifantohana dia nokajiana tamin'ny fandrefesana ny absorbance amin'ny 280 nm mampiasa Nanodrop.Ao amin'ny lavadrano misy lovia mainty tsy mifatotra (Corning) 96-latsaka miaraka amin'ny ambany mazava, ny santionany dia nototoina ho 20 mg / ml amin'ny 20 mM Tris-HCl pH 8 ary mifangaro amin'ny 5 μM ThT (fifantohana farany), totalin'ny santionany. 50 μl ny volume.Ny santionany dia nalaina sary isaky ny 10 minitra amin'ny 37 ° C amin'ny mikraoskaopy CellObserver (Zeiss) miaraka amin'ny fantsom-pahazavana alefa sy ny fisintonana FITC sy ny sivana emission ho an'ny sary ThT.Ny family 20x/0.4 dia ampiasaina amin'ny sary.Zen Blue (Zeiss) sy ImageJ (https://imagej.nih.gov/) dia nampiasaina tamin'ny famakafakana sary.Ny gels koa dia nomanina avy amin'ny vahaolana NT sy His-NT2RepCT amin'ny fifantohana amin'ny 50 mg / mL misy 20 mM Tris pH 8 sy 5 µM ThT ary natsipy tao amin'ny 37 ° C nandritra ny 90 min.Nafindra tao anaty lavaka fantsakana vaovao misy 20 mM Tris, pH 8, ary 5 μM ThT ao anaty lovia ambany 96 mazava tsara mainty tsy mifamatotra ireo sombiny gel.Mahazoa fluorescence maitso sy sary saha mamirapiratra amin'ny 20x/0.4 magnification.ImageJ dia nampiasaina tamin'ny famakafakana sary.
Ny vahaolana NMR spectra dia azo tamin'ny 310 K tamin'ny 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer miaraka amin'ny QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Santionany NMR misy proteinina homogeneous 10 mg / mL misy marika 13C, 15N, levona amin'ny 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w / v) NaN3, 5% DO (v / v), (n = 1) .Ny fiovan'ny simika amin'ny NT2RepCT amin'ny pH 6.7 dia nampiasaina mba hanendrena ny tampon'ny 23 amin'ny spectrum 2D an'ny 15N-HSQC.
Ny zoro majika manodina ny spectra NMR (MAS) mivaingana amin'ny hydrogels 13C, misy marika 15N dia voarakitra ao amin'ny spectrometer Bruker Avance III HD amin'ny 800 MHz miaraka amin'ny 3.2 mm 13C/15N{1H} fanadihadiana tsy misy elektrônika.Ny mari-pana santionany dia nofehezina tamin'ny alàlan'ny entona entona miovaova amin'ny mari-pana amin'ny 277 K. Roa-dimensional dipole rotational resonance (DARR) 76 sy radio frequency reconnection (RFDR) 77 spectra dia azo tamin'ny MAS frequencies 12.5 kHz sy 20 kHz, tsirairay avy.Ny polarization cross (CP) avy amin'ny 1H ka hatramin'ny 13C dia natao tamin'ny alàlan'ny ramp linear avy amin'ny 60.0 ka hatramin'ny 48.0 kHz amin'ny 1H, 61.3 / 71.6 kHz amin'ny 13C (amin'ny 12.5 / 20 kHz MAS) ary ny fotoana fifandraisana 0.5-1 ms.Spinal6478 decoupling amin'ny 73.5 kHz dia nampiasaina nandritra ny fanangonana angona.Ny fotoana nahazoana dia 10 milliseconds ary 2.5 segondra ny faharetan'ny tsingerina.Ny fifandraisana tokana Cα / Cβ voamarika ao amin'ny spectra RFDR dia nomena mifototra amin'ny fiovaovan'ny simika karazana sisa tavela sy ny fifandraisana mifamatotra amin'ny DARR spectra.
Ny angon-drakitra Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) dia nampiasaina hanombanana ny fironana flutter sy ny angovo Rosetta ho an'ny NT, NTFlSp, ary NTMiSp.Ny angon-drakitra Zipper dia manisa an'i Rosetta Energy80, izay manambatra ny angovo maimaim-poana maro ho modely sy hamakafaka ny firafitry ny proteinina.Ny haavon'ny angovo amin'ny -23 kcal / mol na ambany dia manondro ny fironana ambony amin'ny fibrillate.Ny angovo ambany dia midika ho fahamarinan-toerana bebe kokoa amin'ny tady β anankiroa ao amin'ny conformation zipper.Ankoatr'izay, ny algorithm Waltz dia nampiasaina haminavina ny faritra amyloidogenic ao amin'ny NT, NTFlSp ary NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Ny vahaolana proteinina NT dia nafangaro tamin'ny buffer 2- (N-morpholino) etanesulfonic acid (MES) amin'ny pH 5.5 sy 6.0 mba hampidina ny pH amin'ny pH 6 sy 7.Ny fifantohana proteinina farany dia 100 mg / ml.
Ny fandrefesana dia natao tamin'ny J-1500 CD spectrometer (JASCO, Etazonia) tamin'ny fampiasana cuvette 300 μL miaraka amin'ny lalana optika 0.1 cm.Ny proteinina dia nalevina tamin'ny 10 μM (n = 1) tao amin'ny buffer phosphate 20 mM (pH 8).Mba handinihana ny fahamarinan'ny proteinina amin'ny fisian'ny sira, dia nodinihina ny proteinina amin'ny fifantohana mitovy (n = 1) ao amin'ny buffer phosphate 20 mM (pH 8) misy 154 mM NaF na NaCl, tsirairay avy.Ny fitarafana ny mari-pana dia voarakitra ao amin'ny 222 nm avy amin'ny 25 ° C ka hatramin'ny 95 ° C miaraka amin'ny tahan'ny hafanana 1 ° C / min.Ny ampahany amin'ny proteinina mivalona teratany dia nokajiana tamin'ny fampiasana ny formula (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).Ho fanampin'izany, spektra dimy no voarakitra ho an'ny santionany tsirairay avy amin'ny 260 nm ka hatramin'ny 190 nm amin'ny 25 ° C ary aorian'ny hafanana hatramin'ny 95 ° C.Ny spectra dimy dia natao salantsalany, nohamafisina ary niova ho ellipticity molar.Ny data dia nodinihina tamin'ny fampiasana Prism 9.
Ny hamafin'ny fluorescence an'ny His-NT-GFP (300 mg / mL, 80 µL) dia refesina amin'ny triplicate (n = 3) amin'ny takelaka Corning 96-well miaraka amin'ny ambany mangarahara mainty (Corning Glass 3881, Etazonia) eo ambanin'ny fepetra static.Fandrefesana santionany miaraka amin'ny mpamaky takelaka mifototra amin'ny fluorescence miaraka amin'ny halavan'ny onjam-pandrefesana 395 nm ary raketo ny fivoahana amin'ny 509 nm alohan'ny gelation ary 2 ora aorian'ny 37 ° C.Ny data dia nodinihina tamin'ny Prism 9.
Purine nucleoside phosphorylase activity assay kit (fomba fluorometric, Sigma Aldrich) dia nampiasaina araka ny torolalan'ny mpanamboatra.Mba handrefesana ny hetsika amin'ny gels sy ny vahaolana misy His-NT-PNP, afangaro ny 10 ng His-NT-PNP amin'ny 100 mg / mL NT amin'ny totalin'ny 2 µL satria ny gel dia nanome famantarana eo ambonin'ny elanelan'ny fitiliana ny set.Ny fanaraha-maso ny gel sy ny vahaolana tsy misy His-NT-PNP dia nampidirina.Ny fandrefesana dia natao indroa (n = 2).Taorian'ny fandrefesana ny hetsika dia nesorina ny fangaro fanehoan-kevitra ary nalaina sary ny gel mba hahazoana antoka fa tsy misy dikany ny gel mandritra ny fandrefesana.Ny data dia nodinihina tamin'ny fampiasana Prism 9.
Raha mila fanazavana fanampiny momba ny famolavolana fandalinana dia jereo ny abstract study Nature mifandray amin'ity lahatsoratra ity.
Ny sary 1 sy 2 dia mampiseho ny angona voalohany.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, ary 6, Fig fanampiny.3, fanampin'ny an.5a, d, fig.6 ary fanampin'ny fig.8. Ny angona avy amin'ity fandalinana ity dia apetraka ao amin'ny tahiry Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Ny angon-drakitra NMR azo tamin'ity fanadihadiana ity dia navoaka tao amin'ny tahiry BMRBig eo ambanin'ny ID ID bmrbig36.Ny rafitry ny GFP sy PNP dia nalaina tao amin'ny PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. ary Johansson, J. Manodina landy hala artifisialy.National Chemical.biolojia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Ny génome Nephila clavipes dia manasongadina ny fahasamihafan'ny fototarazon'ny landy hala sy ny fomba fiteniny.National Genette.49, 895–903 (2017).